هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح للعلماء بإجراء تحليل وراثي مباشر لمرض الذبول البكتيري في الطماطم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن التلاعب في التعبير الجيني والتشسابات اللاحقة يمكن أن يتم في وقت قصير ومع المتطلبات الصغيرة من المعدات ومساحة نمو النباتات. هذا هو الأسلوب هو تنوعا للغاية، ويمكن تطبيقه على النباتات المحاصيل الأخرى لإجراء كل من التطعيم الممرض وغيرها من المقايسات الفسيولوجية.
للحفاظ على العقم أثناء التلاعب الشتلات في المختبر ، من المهم إبقاء لوحات مغلقة عندما تكون خارج غطاء محرك التدفق. هذه تقنية سهلة، ولكنها تتطلب خطوة متعددة للتلاعب. إن تصور هذه الطريقة سيساعد على رؤية الحيل الصغيرة التي يصعب شرحها في المخطوطة، مما يساعد الباحثين الآخرين على تنفيذ الطريقة في مختبراتهم.
وسوف يساعد في إثبات هذا الإجراء آخن تشاو، وهو طالب دراسات عليا. بعد تعقيم وغسل بذور الطماطم، ونقلها إلى نصف قوة Murashige و Skoog المتوسطة دون السكروز. الحفاظ على البذور في الظلام في درجة حرارة تتراوح بين 25 و 28 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام.
ضع مرشحات ذات 8.5 سنتيمتر مربع داخل أطباق بيتري ذات تسعة سنتيمترات مربعة تحتوي على نصف قوة Murashige وSkoog المتوسط ، ووضع ست بذور طماطم مبتورة على كل لوحة. ختم لوحة مع الشريط Micropore، واحتضان البذور التي تمبت في 25 إلى 28 درجة مئوية لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام. تنمو rh الروماتيزم MSU440 في صلبة LB المتوسطة مع المضادات الحيوية المناسبة لمدة يومين في 28 درجة مئوية قبل التحول النباتي.
باستخدام مشرط معقمة، وقطع الشعاع والجزء السفلي من hypocotyl من شتلات الطماطم. استخدام نصائح من البلاستيك أو شفرة مشرط لحصاد A.rhizogenes الكتلة الحيوية من سطح المتوسط LB، وتراجع بعناية شتلات الطماطم قطع في الكتلة الحيوية البكتيرية. بعد ذلك، قم بتغطية شتلات الطماطم بورق نصف دائري طوله سنتيمترين في أربعة سنتيمترات من أجل الحفاظ على رطوبة عالية وتسهيل البقاء على قيد الحياة وتطوير الجذر الجديد.
من المهم الحفاظ على الشتلات في رطوبة عالية في بيئة تسمح بالتحير. للقيام بذلك، تغطية الشتلات مع ورقة التصفية، وإغلاق لوحة مع الشريط Micropore. تخزين شتلات الطماطم المحولة لمدة ستة إلى سبعة أيام في غرفة النمو في درجة حرارة تتراوح بين 25 و 28 درجة مئوية.
ثم استخدام مشرط عقيمة لقطع جذور جديدة جديدة شعر، والسماح للشتلات لإنتاج جذور جديدة شعر. مرة واحدة في الجيل الثاني من جذور جديدة شعر يظهر، وإزالة ورقة تصفية على رأس الشتلات، وختم لوحة مع الشريط Micropore مرة أخرى. لتصور DsRed fluorescence أو أي معدات أخرى للمصنع في التصوير في الجسم الحي، علامة على الجذور التحويلية الإيجابية، والتي يمكن تحديدها من قبل الفلوريسنسي الأحمر.
استخدام مشرط لإزالة الجذور السلبية غير المحولة، والتي يمكن تحديدها من خلال عدم وجودها من الفلورا الحمراء. نقل الشتلات التي تظهر الفلوريسين الأحمر إلى لوحة جديدة تحتوي على نصف قوة Murashige وSkoog المتوسطة من أجل تسهيل تطوير الجذر المحولة باعتبارها الجذر الرئيسي. الحفاظ على الشتلات التي لا تظهر الفلوريسين الأحمر في نفس لوحة للتحقق من ظهور جذور الفلورسنت في نقاط زمنية لاحقة.
غطي الشتلات بورق نصف دائرة طوله سنتيمترين في أربعة سنتيمترات، وختم الطبق، واحتضان الشتلات للسماح لها بتطوير جذور جديدة مشعرة. إعداد الأواني تلقيح حيث سيتم تعرض سطح الجذور إلى تلقيح بكتيرية عن طريق أولا نقع الأواني التطعيم بالماء، صب قبالة أي ماء الزائدة، ومن ثم وضعها في علبة زراعة بلاستيكية. باستخدام الملاقط، نقل الشتلات المختارة مع جذور محولة إلى الأواني التطعيم.
غطي الصينية بلفاف بلاستيكي أو غطاء شفاف، واحفظها عند درجة حرارة 25 إلى 28 درجة مئوية مع رطوبة 65٪. إزالة الغطاء بعد خمسة أو ستة أيام. تنمو Ralstonia في خمسة LB المتوسطة السائلة في شاكر المدارية في 28 درجة مئوية، مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة، حتى المرحلة الثابتة.
قياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر لتحديد أعداد البكتيريا. تمييع الثقافة البكتيرية بالماء إلى OD600 من 1. مكان 16 إلى 20 وعاء التطعيم التي تحتوي على نباتات الطماطم المحولة إلى علبة تطعيم.
ثم صب 300 ملليلتر من inoculum البكتيريا المخففة في علبة، والسماح للنباتات لنقع في inoculum لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، إعداد صينية جديدة مع طبقة من التربة بوتينغ. نقل الأواني المحقوطة في علبة جديدة، ووضع الصواني في غرفة النمو مع الرطوبة 75٪، ودرجة حرارة بين 26 و 28 درجة مئوية، وphotoperiod من 12 ساعة من الضوء و 12 ساعة من الظلام.
هنا، يتم تحويل جذور الطماطم وتلقح مع Ralstonia لإجراء تحليل وراثي مباشر لدراسة مرض الذبول البكتيري. يتم تتبع تطور أعراض المرض في نباتات الطماطم مع جذور تحولت مع ناقل فارغ وتلك التي تحولت مع بناء RAI تستهدف الطماطم CESA6. يتم جمع بيانات مؤشر المرض من نفس الوحدة التجريبية مع مرور الوقت وفقًا لمقياس تعسفي من صفر إلى أربعة ولا تتبع توزيعًا غوسيًا ، مستبعدًا استخدام الاختبارات القياسية للبيانات البارامترية.
والنهج القياسي، يتم استخدام U Mann-Whitney، اختبار غير قياسي ذو ذيلين لمقارنة منحنيات التحكم والعدوى. ووفقا لهذا التحليل، يبدو أن الفرق بين متوسطات المنحنيتين غير ذي شأن. ومن الممكن أيضاً تحديد المنطقة الواقعة تحت منحنى تقدم المرض، الذي يسمح بالجمع بين الملاحظات المتعددة لتقدم المرض في قيمة واحدة.
المنطقة تحت منحنى تقدم المرض يظهر قيمة أعلى للنباتات التحكم بالمقارنة مع النباتات CESA6 الطماطم RNAi في نهاية عملية العدوى، مما يدل على أن النباتات CESA6 الطماطم صامتة هي أكثر مقاومة للعدوى رالستونيا من النباتات السيطرة. توفر فواصل الثقة طريقة لتقدير نطاق من القيم، مع احتمال كبير، حيث توجد قيمة المحتوى لمتغير معين. كما رأينا هنا، فإن منطقة الفاصل الزمني للثقة بنسبة 95٪ للتحكم ومنحنيات العدوى تقدر وجود فرصة أعلى للمقاومة عندما يتم إسكات CESA6.
يمكن تحويل قيم مؤشر الأمراض إلى بيانات ثنائية، مع الأخذ في الاعتبار مؤشر المرض أقل من اثنين يقابل صفر ومؤشر المرض يساوي أو أعلى من اثنين يقابلان واحد. هذا يسمح بتمثيل منحنى البقاء على قيد الحياة بعد تلقيح Ralstonia. الاختلافات في معدل البقاء على قيد الحياة بين السيطرة والنباتات المصابة ليست ذات دلالة إحصائية وفقا للاختبار الإحصائي جيهان- بريسلو ويلكوكسيون.
ثم يتم تحليل التعبير عن CESA6 في اثنين من الجذور المحولة المختارة عشوائيا قبل خطوة التطعيم، مما يدل على أن المقاومة المعززة لRalstonia يرتبط مع التعبير المخفض من CESA6. بعد جولتين من الاختيار، يمكن الحصول على معدل تحويل من 35 إلى 40٪، ويمكن زيادة هذه القيمة عن طريق إجراء جولات اختيار إضافية. أثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم الحفاظ على الشتلات مغطاة بقطعة من ورق التصفية للحفاظ على الرطوبة العالية وختم لوحات مع Micropore لضمان تبادل الغاز.
بعد التحول الجذري ، يمكن تطبيق العديد من العلاجات لدراسة استجابة النبات عن طريق مراقبة فسيولوجيا الجذر أو استخدام البيولوجيا الجزيئية ، وبيولوجيا الخلايا ، أو الكيمياء الحيوية. بشكل رئيسي، سوف تسمح هذه التقنية للباحثين ذوي الموارد المحدودة بإجراء التحليل الجيني للعدوى البكتيرية في جذور الطماطم.
