هل فكرت في أي وقت من قبل حول تسخير قوة التقاط الليزر microdissection لتحليل التعبير الجيني في خلايا العظام محددة داخل بيئتها الطبيعية؟ هنا، ونحن وصف بروتوكول من شأنها أن تمكنك من الحصول على كميات كافية من الحمض النووي الريبي عالية الجودة من اكيات من عظام الماوس. هذه التكنولوجيا هي أداة عظيمة لدراسة التغيرات في التعبير الجيني في خلايا العظام محددة في نماذج الماوس المعدلة وراثيا أو في نماذج المرض.
ويركز البروتوكول الموصوف هنا على عظام الفأر، ولكن يمكن استخدامه لدراسة التعبير الجيني في الموقع في خلايا أي أنسجة صلبة في أي نوع. تساعد على إثبات هذا الإجراء، وسوف يكون كريستيان شولر، وهو فني من مختبري. بعد القتل الرحيم الفئران عن طريق exsanguination تحت التخدير العام، وإزالة عظم الفخذ كله بسرعة.
استخدم مشرط ومناشف ورقية لتنظيف عظم الفخذ من الأنسجة الرخوة المحيطة. المقبل، صب مركب درجة حرارة القطع الأمثل في قالب تضمين ووضع عظم الفخذ في الجزء السفلي من القوالب المضمنة. المفاجئة تجميد العينات في النيتروجين السائل.
بمجرد تجميد العينات بالكامل ، لفها في احباط ونقلها على الجليد الجاف إلى ثلاجة. تخزينها في ناقص 80 درجة مئوية حتى جاهزة لمزيد من المعالجة. أولا، تعيين درجة الحرارة في التبريد إلى ناقص 19 درجة مئوية ودرجة حرارة حامل كتلة إلى ناقص 17 درجة مئوية.
بعد ذلك، امسح الجزء الداخلي من التبريد مع 70٪ الإيثانول. ضع الشفرة التي يمكن التخلص منها للأنسجة الصلبة والشرائح الزجاجية وأداة مناسبة في الكودوستات لتبرد، واحفظها داخل الكرودوستات لمدة القطاعات. نقل كتلة الأنسجة المجمدة على الجليد الجاف إلى التبريد والسماح لها لتكواد لمدة 10 دقائق على الأقل.
ثم، اضغط على الجزء السفلي من القالب تضمين لدفع كتلة أكتوبر للخروج من القالب. تطبيق ما يكفي من أوكت المتوسطة إلى حامل كتلة للتمسك كتلة إليها والانتظار حتى يتجمد متوسطة أكتوبر تماما. بعد ذلك، ضع حامل الكتلة في حامل الجسم و شده في مكانه.
ضبط موقف شفرة وتقليم كتلة في 15 ميكرومتر الزيادات قطع لإزالة OCT تغطي العينة. ضبط التبريد لتوليد ثمانية ميكرومتر أقسام وقطع اثنين إلى ثلاثة اقطات اكيتيونات التي سيتم التخلص منها. وضع فيلم لاصق على كتلة واستخدام أداة المناسب للتمسك الفيلم إلى كتلة.
الآن، وجعل خفض ببطء وبسرعة ثابتة، في حين عقد القسم من الفيلم. ضع الفيلم مع العينة التي تواجه على شريحة الزجاج قبل تبريدها على cryobar داخل التبريد لتجنب ذوبان العينة. استخدام الشريط لإصلاح الفيلم إلى الشريحة الزجاجية لتسهيل تلطيخ.
في غطاء الدخان، وإعداد الحلول اللازمة من الإيثانول، RNase خالية من المياه، والزيلين على الجليد كما هو مبين في بروتوكول النص. احتضان الأقسام في 95٪ الإيثانول لمدة 30 ثانية. ثم، تراجع بعناية المقاطع في المياه الخالية من RNase لمدة 30 ثانية لإزالة تماما أكتوبر.
المقبل، الاستغناء 50 ميكروليتر من LCM التجارية وصمة عار المقطع المجمدة على القسم واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 ثانية. استنزاف القسم عن طريق وضع حافة الشريحة على ورق الأنسجة الماص. شطف القسم في 100٪ الإيثانول لمدة 30 ثانية لإزالة أي وصمة عار الزائدة.
اغمر أقسام العظام في أنبوب ثان يحتوي على 100٪ من الإيثانول لمدة 30 ثانية ثم قم بنقلها إلى 100٪ من الزيلين لمدة 30 ثانية. وضع فيلم لاصق على شريحة الزجاج الجاف كدعم، مع الحرص على وضع الفيلم شقة قدر الإمكان. بعد ذلك، ضع شريحة إطار غشاء PET على الفيلم واضغط لفترة وجيزة على إصبع قفاز على الغشاء لإرفاقه بالفيلم.
وسوف تقع هذه العينة بين الغشاء والفيلم لاصق. لا ينبغي أن تكون مطوية أو التجاعيد فيلم لاصقة ، ويجب أن يكون هناك أي فقاعات الهواء بين الفيلم والغشاء. ابدأ باستخدام مطهر السطح لتنظيف حامل الغطاء النهائي للمرحلة.
قم بتحميل الشريحة إلى حامل الشريحة والأحرف الكبيرة إلى حامل الغطاء. بعد ذلك، قم بضبط التركيز والحصول على نظرة عامة على الشريحة مع الهدف 1.25x. تغيير إلى الهدف 40x وضبط التركيز.
باستخدام نظرة عامة على الشريحة، اختر منطقة الاهتمام. ثم، ضبط المعلمات الليزر كما هو مبين هنا، مع التأكد من تحسين هذه المعلمات لكل هدف. إذا فشل الليزر لقطع العينة، وزيادة قوة الليزر.
حدد خلايا العظام والعظام والخلايا بطانة العظام في عظم الفخذ أو القشرية على أساس معايير morphologic. رسم خط لمسار الليزر أبعد من الخلايا المستهدفة لتقليل الضرر بواسطة الليزر الأشعة فوق البنفسجية. إذا فشل الليزر في قطع العينة، وتطبيق الليزر أكثر من مرة أو فحص الهدف للبقع من التخفيضات غير مكتملة واستخدام خيار التحرك وقطع لقطع الأنسجة في هذه البقع.
جمع كل نوع خلية في 0.5 ملليلتر منفصلة أنبوب الغطاء. أولاً، الاستغناء عن 50 ميكروليتر من العازلة تحلل التي تحتوي على بيتا mercaptoethanol في قبعة أنبوب جمع. lyse العينة عن طريق pippetting عنه صعودا وهبوطا في الغطاء لمدة دقيقة واحدة.
المقبل، تدور أسفل lysate وإضافة 00 ميكرولتردات من العازلة تحلل التي تحتوي على بيتا-mercaptoethanol إلى الأنبوب. لكل شريحة، إعداد أنبوب microcentuge المسمى مع 350 ميكرولترات من العازلة تحلل تحتوي على mercaptoethanol بيتا. استخدم الأقسام المتبقية بعد LCM لاستخراج RNA.
فصل الفيلم بعناية من الغشاء وlyse العينة عن طريق pippetting ببطء العازلة تحلل على القسم عدة مرات. ثم، وضع عينات lysate على الجليد الجاف وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية. عندما تكون على استعداد للمتابعة، ذوبان في lysates في درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك، نقل lysates من الخلايا التي يتم حصادها LCM في أنابيب جمع إلى أنابيب جديدة 1.5 ملليلتر microcentrifuge واستخراج الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. في هذه الدراسة، تم تطوير بروتوكول LCM للحصول على كمية كافية من الحمض النووي الريبي عالية الجودة لتحليل التعبير الجيني في الخلايا العظمية من عظم الفخذ الماوس. يتم تنفيذ LCM باستخدام نظام LCM الذي يستخدم الجاذبية لجمع العينات.
تم قياس العائد والسلامة من الحمض النووي الريبي المعزول باستخدام الكهرباء الكابيلية الدقيقة. ويمكن رؤية الفرق في نوعية الحمض النووي الريبي وكميته التي تم الحصول عليها باستخدام بروتوكولات التحلل المختلفة هنا في الجل التمثيلي والكهرباء. عندما يتم lysed العينة بواسطة pippetting صعودا وهبوطا في الغطاء لمدة دقيقة واحدة، فمن الممكن لعزل ما يقرب من 8.5 نانوغرام من الجيش الملكي النيبالي من ملليمتر مربع واحد من نسيج العظام microdissected.
قيمة RIN هي 8.60. بدلا من ذلك، يتم تنفيذ LCM باستخدام نظام LCM الذي يستخدم نبض الليزر مزيل الأوجه، الذي ينقل المواد إلى غطاء لاصق معلقة. بالنسبة للعظام الطازجة المجمدة، من الممكن عزل حوالي 1.6 نانوجرام من الحمض النووي الريبي من ملليمتر مربع واحد من أنسجة العظام الجزئية.
قيمة RIN هي واحدة. في الختام، أهم الأشياء التي يجب تذكرها في هذا الإجراء هي تطبيق البروتوكول الدائم بالطريقة الصحيحة، ومنع الجفاف الكامل من الأقسام في مجمع الساندويتش، واستخدام نظام LCM مناسب، ولا تتجاوز الحدود الزمنية لحصاد الخلايا. بمجرد أن يكون لديك عزل RNA من الخلايا الملتقطة، يمكنك استخدام الحمض النووي الريبي للتعبير التنميط، على سبيل المثال، بواسطة RNA تسعى.
وأخيراً، نود أن نذكركم بأن الزيلين وبيتا ميركابتوتانول هما من المواد الخطرة التي تحتاج إلى التعامل معها تحت غطاء محرك السيارة. بالإضافة إلى ذلك، يرجى اتخاذ الاحتياطات المناسبة عند التعامل مع النيتروجين السائل وكذلك شفرات التبريد.
