هذا البروتوكول مهم ، لأنه يستخدم طريقة تصور خالية من البقع بدلاً من التصور القائم على الصبغة على أنسجة الدماغ البشرية بعد الوفاة ، مما يساعد على الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. الحفاظ على الحمض النووي الريبي هو ميزة كبيرة في هذا البروتوكول، كما أنه مفيد، ليس فقط في أنسجة الدماغ البشرية بعد الوفاة، ولكن أيضا أنواع الأنسجة الأخرى، مع نشاط RNase عالية. للبدء، إزالة الأنسجة من الفريزر ووضعها على الجليد الجاف لنقلها إلى التبريد.
ضع الفرش النظيفة والتشاك والأنسجة في التبريد لمدة 20 دقيقة على الأقل ، للسماح لهم بالوصول إلى درجة الحرارة المثلى. بالنسبة للجريد مع غرف مزدوجة ودرجات حرارة عقد العينات، تعيين درجة حرارة الكائن إلى ناقص 16 درجة مئوية ودرجة حرارة الغرفة إلى ناقص 18 درجة مئوية. تعيين سمك قسم cryostat إلى 14 ميكرومتر وسمك تقليم إلى 30 ميكرومتر.
بعد ذلك، قم بتنظيف المسرح بمزيج واحد إلى واحد من إزالة التلوث RNase و 70٪ من الإيثانول، لمنع التجميد. الحصول على جديد, شفرة التبريد المتاح وتنظيفه مع إزالة التلوث RNase. ضع الشفرة النظيفة في حامل النصل على المسرح.
ثم، تنظيف لوحة مكافحة لفة مع إزالة التلوث RNase. نعلق لوحة نظيفة إلى المسرح وانتظر ما لا يقل عن 20 دقيقة لنصلة و لوحة لمكافحة لفة أن ينزل إلى درجة حرارة التبريد. أولاً، قطع قطعة صغيرة من الأنسجة للقطع، والتأكد من أن القسم هو قشرة المخيخ 95٪ تقريبًا.
إعادة الأنسجة المتبقية إما إلى الثلج الجاف، أو إلى الفريزر، في ناقص 80 درجة مئوية. المقبل، تبدأ بإضافة ببطء أكتوبر على رأس تشاك مع بطيئة، حركة دائرية. بناء طبقات من OTC حتى يكون هناك جبل ما يقرب من ثلاثة ملليمترات عالية تغطي تشاك.
عندما يتم تجميد OCT جزئيا، ولكن لا يزال لديه بعض السائل في المركز، ووضع الأنسجة على رأس جبل. دع الأنسجة تجلس على قمة أكتوبر لمدة دقيقة إلى دقيقتين حتى يتم تجميدها تمامًا. ثم، نقل تشاك مع أكتوبر المجمدة والأنسجة في ذراع قطع التبريد.
ضبط الأنسجة بحيث يكون دافق مع شفرة القطع والسماح للأنسجة الجلوس في الذراع قطع لمدة 20 دقيقة للتكيف مع درجة الحرارة الجديدة. الخطوة الأكثر أهمية هو السماح للأنسجة للتأقلم في ذراع القطع المبردة لطالما لزم الأمر. إذا كانت الأنسجة أجاد، سوف تصور الخلايا purkinje يكون من الصعب جدا.
أوصي باستخدام أصغر، أرق قطعة من الأنسجة، للسماح للأنسجة لتأقلم أسرع. بعد ذلك، ببطء نقل الأنسجة أقرب إلى شفرة. بمجرد أن يصل النسيج إلى الشفرة ، ابدأ عملية التشذيب.
تقليم الأنسجة مرتين إلى ثلاث مرات، حتى طبقات القشرة مرئية. بعد ذلك، ضع ومحاذاة لوحة مكافحة لفة فقط فوق شفرة التبريد. قطع أربعة إلى ستة أقسام التي هي 14 ميكرومتر سميكة، مشيرا إلى أن قطع أقسام بشكل صحيح سوف تكون مسطحة تحت لوحة مكافحة لفة.
محاذاة أقسام القطع أفقيا عبر مرحلة التبريد. زاوية شريحة لالتقاط جميع قطع الأنسجة في وقت واحد. مباشرة بعد تقسيم الأنسجة، ضع الشريحة في حامل الشريحة مع 70٪ الإيثانول على الجليد لمدة دقيقتين.
نقل الشريحة إلى حامل شريحة مع 95٪ الإيثانول على الجليد لمدة 45 ثانية. بعد ذلك، ضع الشريحة في حامل الشريحة مع الإيثانول بنسبة 100٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. تراجع الشريحة ثلاث مرات في حامل الشريحة التي تحتوي على إكسيلين رقم واحد في درجة حرارة الغرفة.
ثم ضع الشريحة في حامل الشريحة مع الزيلين اثنين في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. الوقوف الشرائح في غطاء الدخان نظيفة والسماح لهم الهواء الجاف لمدة 30 دقيقة على الأقل. إذا تخزين الشرائح، ضع كل واحد في أنبوب 50 ملليلتر منفصلة ووضع الأنابيب في ثلاجة في ناقص 80 درجة مئوية لمدة تصل إلى سبعة أيام.
أولا ، استخدم RNase إزالة التلوث لتنظيف مرحلة المجهر وذراع جمع الغطاء. مع اليدين قفاز، ووضع الشريحة على المجهر وغطاء 500 microliter معتمة في ذراع جمع. عند التكبير المنخفض، محاذاة الغطاء المبهم على نسيج cerebellar، مما يضمن أن الغطاء يغطي المنطقة بأكملها التي يتم تصورها في قطعة العين.
استخدام خمس مرات إلى 10 مرات الهدف لتصور طبقات cerebellar. ضع المؤشر فوق القسم حيث تتقاطع الطبقة الجزيئية وطبقة الخلايا الحبيبية. الانتقال إلى التكبير 40 مرة وتصور خلايا purkinje.
ثم، تبدأ في التقاطها. لبدء جمع الحمض النووي الريبي بعد microdissection، إضافة 50 ميكرولترات من العازلة تحلل الخلية إلى الغطاء معتمة مع غطاء تواجه لأعلى. أغلق الأنبوب بعناية فوق الغطاء وقم بالمتابعة مع المجموعة كما هو موضح في بروتوكول النص.
في هذا البروتوكول، الطازجة، المجمدة، بعد الوفاة، يتم إعداد أنسجة الدماغ البشرية لالتقاط الأشعة فوق البنفسجية الليزر microdissection. بعد اقسام التبريد في وقت الرسم المخصص ، تكون الطبقات الخلوية من المخيخ مرئية بسهولة مع خمس مرات وعدسات 10 مرات موضوعية. كما رأينا هنا، الحضانة الزيلين السليم يسبب الأنسجة لتصبح أكثر قتامة ويسيم الطبقات الخلوية أفضل من الإيثانول وحده.
عند القطع في مجهر التقاط الليزر، مطلوب العدسة 40 مرة الهدف لضمان التقاط الخلايا البوركيني فقط وليس الأنسجة المحيطة بها. كما رأينا هنا، تنتج الحضانة المناسبة في إكسيلين صورة ذات جودة عالية سليمة شكليا بالمقارنة مع تثبيت الإيثانول وحدها. ثم يتم اختبار قدرة زلة الغطاء من غطاء معتم بينما تستخدم بروتوكولات أخرى غطاء مملوء بالسائل ، يمكن لهذه القبعات تقليل تصور الأنسجة وتسبب الصورة الناتجة لتكون حبيبية وهارميدسنت تحت المجهر.
ومع ذلك، التصور من خلال غطاء مبهمة النتائج في مظهر الأنسجة الملساء التي هي أكثر ليونة وأكثر وضوحا في الشكل. تظهر الصور التمثيلية لخلايا purkinje المختَرة عند انخفاض الطاقة وفي الطاقة العالية إزالة دقيقة للجسم الخلوي البوركنيجي فقط. بعد ذلك، يتم الحصول على جودة عالية Rnase لتسلسل الحمض النووي الريبي اللاحقة.
وخضعت ست عينات تمثيلية لاستخراج الحمض النووي الريبي وتم إعادة تعليقها في 14 ميكرولترات من المياه الخالية من رناز، وأنتجت جميع العينات الست رنا عالية الجودة بأرقام سلامة الحمض النووي الريبي تساوي أو تزيد على ثمانية. أهم شيء يجب تذكره هو أن جودة الأنسجة هي كل شيء. حتى القطع ووضع الشريحة سيجعل أو كسر هذا البروتوكول.
بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ أي طريقة تحقق الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي، وعلى وجه التحديد نحن التحقيق لدينا RNA للتعبير الجيني التفاضلي، ولكن يمكن أيضا التحقيق في أسئلة أخرى تتعلق بتنظيم الجينات. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على أي نوع من الأنسجة التي لديها مورفولوجيا محددة لا تتطلب استخدام مستضد أو الكواشف صبغ محددة لتحديد الخلايا ذات الأهمية. نأمل أن تساعدنا هذه التقنية على فهم علم الوراثة من الهزة الأساسية وغيرها من الأمراض التي لها نمط ظاهري الهزة.
المادة الكيميائية الأكثر خطورة المستخدمة في هذا البروتوكول هي الزيلين. وينبغي أن تعالج بشكل صحيح في غطاء الدخان، والتخلص من بشكل صحيح، وينبغي السماح للشرائح لتجف بشكل كاف حتى تستخدم في مساحة مفتوحة. بالإضافة إلى ذلك، عند العمل مع العينات البشرية، ينبغي استخدام إدارة النفايات الحيوية والسلامة.
