في هذا الفيديو، ونحن شرح كيفية التعبير عن بنيات الحمض النووي الخارجية في الخلايا العصبية البصرية وكيفية صورة الفردية GFP التعبير عن الأربر المحورية البصرية في سليمة، ويعيش Xenopus المغافلين. هذا هو غير مكلفة، إجراء بسيط لtransgenesis الخلية محددة عابرة التي تسمح بتحديد الخلية وظيفة الجينات المستقلة في الأربر المحورية البصرية الفردية، النامية في نظام نموذج الفقاريات الحية. إثبات الإجراء سيكون أنا، صوفيا داو، مساعد باحث، والدكتورة تاميرا إيلول، المحقق الرئيسي في المختبر.
للبدء، مقطع بلطف غيض من ماصة شعرية صغيرة الزجاج سحبت مع ملقط غرامة. ردم ماصة الشعيرات الدموية الصغيرة الزجاجية مع الزيوت المعدنية باستخدام MICROFIL بحيث تظهر قطرة صغيرة من الزيت المعدني في طرف قص من ماصة صغيرة. ملء ماصة شعرية صغيرة الزجاج في منتصف الطريق مع الزيوت المعدنية.
في حاقن، طرد المكبس في منتصف الطريق وتحميل ماصة الشعيرات الدموية الصغيرة الزجاجية المسحوبة إلى حامل الحقن. ثم تمديد المكبس إلى أقصى حد للتأكد من أن ماصة الشعيرات الدموية الصغيرة تعلق بقوة على حاقن ولا تتحرك مع تمديد المكبس. نقل قطرة ثلاثة ميكرولتر من خليط الحمض النووي / DOTAP على ورقة مربعة بوصة واحدة من ورق البارافين.
تحت المجهر ستيريو تشريح، نقل غيض من ماصة شعرية صغيرة الزجاج في إسقاط الحمض النووي / DOTAP. استخدام خيار ملء على جهاز الحقن، وامتص ببطء إسقاط الحمض النووي / DOTAP في ماصة الشعيرات الدموية الصغيرة الزجاج. الحدود بين الزيت المعدني وحل الحمض النووي/DOTAP مرئية في ماصة الشعيرات الدموية الصغيرة الزجاجية بسبب التعتيم الطفيف من حل الحمض النووي/DOTAP.
إذا لزم الأمر، والتوقف عن ملء ماصة الشعيرات الدموية الصغيرة بشكل دوري للسماح للضغط في ماصة الشعيرات الدموية الصغيرة الزجاج لإعادة معايرة. أولاً، في طبق بيتري سعة 10 ملليلتر مملوء بـ 0.1X MMR، دو فيتيلينيز يدوياً 10 مرحلة 20 إلى 24 جنين Xenopus مع ملقط ناعم. استوعب مظروف vitelline عند الخصر لتجنب إصابة الأجنة.
مع ملقط في كل من اليد اليسرى والأيّني للمُجرّب، اِبْرْ فقاعة مظروف vitelline وحرر الجنين من مظروف vitelline. الحرص على عدم إصابة الأجنة عند إزالة المغلف vitelline. ثم استخدام ماصة نقل البلاستيك مع تلميح قطع لنقل خمسة إلى 10 مرحلة de-vitellinized 22 إلى 24 أجنة إلى طبق بيتري 10 ملليلتر مليئة 1X MMR.
تحت مجهر ستيريو، فهم واحد من الأجنة دي vitellinized في طبق بيتري مع ملقط وترتيب الجنين بحيث يتم الإشارة إلى القطب الأمامي في مجال الرؤية. ثم توجيه الجنين بحيث يكون مستلقياً بشكلٍ مُراقَب، ويواجه أحد براعم العين اليمنى إلى اليسار صعودًا. عقد الجنين مع ملقط في اليد غير المجرب ومع اليد المهيمنة للمجرب، وإدخال غيض من ماصة صغيرة الزجاج من الجانب البطني أو الظهري فقط تحت البشرة في برعم العين.
حقن ما بين 70 إلى 210 نانولترات من محلول الحمض النووي/DOTAP. ثم تحويل الجنين حول وتنفيذ الحقن الدقيقة نفسها في برعم العين الأخرى على الجانب الآخر من الجنين. حقن كل من براعم العين من ستة إلى 10 أجنة في كل تجربة.
بعد الحقن الدقيق، قم بتخزين الأجنة في طبق بيتري مع 1X MMR لمدة 30 دقيقة تقريبًا لتسهيل التئام الجروح. بعد 30 دقيقة، نقل الأجنة المحقونة مع ماصة نقل البلاستيك إلى حل MMR 0.1X مع 0.001٪ وكيل التبييض فينيلثيوكارباميد للحد من التصبغ. غطي طبق بيتري بغطاء لثقافة الأجنة لمدة خمسة أيام تقريباً حتى تتطور الأجنة إلى شراغ في المراحل من 46 إلى 47.
هذا البروتوكول يعطي معدل نجاح من 30 إلى 60٪ من الأجنة Xenopus حقن التعبير عن GFP في واحد إلى 10 arbors محور عصبي بصري. تظهر الصور confocal التمثيلية من GFP السيطرة المعبرة وarbors محور عصبي بصري متحولة في الشراغوف Xenopus سليمة. تم استنساخ اثنين من المسوخ المجال من APC، APCNTERM، وAPBbeta القط في psmids pCS2.
وأعيد بناء صور السلسلة Z لمراقبة GFP وأربورات ضوئية متحولة من نوع APC. المؤامرات من عدد الفروع، مجموع طول فرع arbor، ومتوسط طول الفرع تؤكد الاختلافات الملاحظة بين السيطرة و APC متحولة تعبر عن أربور محور عصبي. إظهار مخططات مبعثر إضافية من عدد الفروع مقابل متوسط طول الفرع مع خطوط الانحدار ارتباط عكسي بين هذه المعلمات وarbors المحور المحوري البصرية التي تعبر عن نطاقات APC.
يجب أن يتم إدراج طرف ماصة الشعيرات الدموية الدقيقة بشكل صحيح بشكل سطحي جدا في برعم العين بحيث البشرة الرمادية الإفراط في براعم العين تتضخم خلال كل حقنة صغيرة. يمكن استخدام هذا الإجراء لكل من تسمية وتغيير وظيفة وراثية محددة في الخلايا العصبية البصرية مع تقييم النمو، واستهداف، وتفريع من محاور عصبية من هذه الخلايا العصبية البصرية. وقد سمحت هذه الحقن الدقيق الحمض النووي وتقنية الشفط الباحثون في علم الأعصاب التنموي لدراسة الآليات الجزيئية المستقلة الخلية التي تنظم arborization محور عصبي البصري في سليمة، يعيش Xenopus الضفادع laevis.
