نظام النواة متجه العدستية لديها ميزة كبيرة على منصة ناقلات الأكثر شعبية، وتحديدا بسبب قدرة ناقلات العدسي الفيروسية لاستيعاب إدراج أكبر الوراثية. وهكذا، يبدو أن ناقل العدسي الفيروسي سيكون منصة الاختيار في التطبيق تنطوي على تسليم CRISPR / أدوات كاس. هذه التقنية تقليد الآلية التنظيمية الطبيعية للتعبير ألفا-سينوكلين التي عندما تضعف ترتبط مع المرض.
وهو يسمح بصقل مستوى التعبير مقابل التغيرات القوية في التعبير الجيني. أود أن أوصي بشدة التحقق من صحة هذا النهج أو ما شابه ذلك باستخدام RNAs دليل متعددة للفحص. هناك قدر كبير من التقلبات في قوة RNA دليل.
والطريقة الوحيدة لتحديد ذلك هو وجود فحص قوي وشامل والتحقق من الصحة. ويمكن بسهولة تكييف النظام المطور مع أنظمة نموذجية أخرى مثل النماذج الحيوانية بما في ذلك القوارض والرئيسات غير البشرية. هذه المتابعة يمكن أن تكون بمثابة دليل على مفهوم الدراسات السريرية في المستقبل.
وسوف يكون إثبات الإجراء الدكتور إيكاترينا Ilich، وهو موظف كبير في مختبري، مع التركيز على تنفيذ إجراء الاستنساخ الجزيئي لإنشاء بلاسميدس ناقل لينتيفيرال ذات الصلة بهذا المشروع. وقالت انها سوف تظهر أيضا الخطوات الرئيسية التي ينطوي عليها إنتاج ناقلات العدين الفيروسية. كما سيتم إثبات الإجراء سيكون الدكتور ليديا Tagliafierro، وهو ما بعد الدكتوراه من مختبري مع التركيز على تمايز خلايا iPS البشرية إلى الخلايا المرضية ذات الصلة.
وقالت انها سوف تظهر الخطوات الرئيسية في إنشاء المقايسات لتقييم ملامح الميثيل من synuclein intron1. Ahila Sriskanda ، وهو موظف في مختبري مع التركيز على ثقافة الخلايا الجذعية الخلايا العصبية المشتقة من iPS الإنسان. للبدء، تطوير المجال الحفاز DNMT3A من d-Cas9-DNMT3A-GFP عن طريق تضخيم جزء DNMT3A من المتجه.
بعد هضم جزء DNMT3A باستخدام إنزيم تقييد BAMH1. Cloat في موقع BamH1 من ناقلات PBK-301 المعدلة التي تحمل د-Cas9 والتحقق منها من قبل تسلسل سانجر المباشر، لتحل محل الجين مراسل Meissen النقي وbasmid الناتجة مع GFP هضم د-Cas9-DNMT3A-P2A ميسين نقية وبلازميد مع FSC 1. تنقية الجزء المتجه باستخدام طريقة تنقية هلام.
إعداد إدراج عن طريق هضم PBK-201 مع FSC-1. استنساخ 1 FSC جزء في ناقلات لإنشاء d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP. معطف 15 سم مع 0.2٪ الجيلاتين لtransfefection وانتظر لمدة 10 دقائق.
ثم pirate الجيلاتين وإضافة 22.5 ملليلتر من ارتفاع الجلوكوز المتوسطة و 2.5 ملليلتر من سابقا مثقف HEK-293T تعليق الخلية. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 حتى تصل إلى 70 إلى 80٪ التقاء. لتحضير مزيج البلازمي يكفي لصفيحة 115 سنتيمتر استخدم البلازميدات الأربعة الموصوفة في المخطوطة.
إضافة 312.5 ميكرو لتر من كلورايد الكالسيوم الضرس واحد إلى نفس أنبوب 15 ملليلتر مع البلازميدات وتقديم الحجم النهائي إلى 1.25 ملليلتر باستخدام الماء المقطر المزدوج العقيمة. إضافة بلطف 1.25 ملليلتر من اثنين من حل BBM X إسقاط الحكمة إلى أنبوب أثناء دوامة. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
التعرق المتوسطة من الخلايا وإضافة 22.5 ملليلتر من DMEM عالية الجلوكوز أعدت طازجة دون المصل. إضافة 2.5 ملليلتر من الخليط transfection قطرة الحكمة إلى كل لوحة. دوامة لوحات واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات بعد الحضانة إضافة 2.5 ملليلتر من المصل لكل لوحة لتحقيق 10٪ تخفيف واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
لحصاد الفيروس جمع نابير من جميع الخلايا المصابة وسحبها في أنابيب مخروطية 50 ملليلتر. جهاز طرد مركزي في 400 إلى 450 غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ومن ثم تصفية فائقة من خلال 0.45 وحدة تصفية فراغ ميكرومتر. المقبل إنشاء التدرج السكروز عن طريق إعداد أنابيب مخروطية فائقة الطرد المركزي.
إضافة بعناية عظمى المصفاة إلى التدرج عن طريق توزيع على قدم المساواة فائقة الفيروسية بين كل أنبوب الطرد المركزي جدا ملء ما لا يقل عن ثلاثة أرباع كل أنبوب. أجهزة الطرد المركزي العينات في 70000 غرام لمدة ساعتين في 17 درجة مئوية. جمع بلطف 30٪ إلى 60٪ كسور السكروز في أنابيب نظيفة إضافة 1X PBS الباردة تصل إلى 100 ملليلتر من الحجم الإجمالي والماصات عدة مرات لخلط.
إضافة بعناية أربعة ملليلتر من 20٪ السكروز في 1X PBS إلى كل أنبوب لتطنيج إعداد الفيروسية تستمر عن طريق الأنابيب ما يقرب من 20 إلى 25 ملليلتر من الحل الفيروسي لكل أنبوب. توازن بعناية الأنابيب ثم الطرد المركزي في 70000 غرام لمدة ساعتين في 17 درجة مئوية. التعرق بعناية السائل المتبقي لإزالة تماما كل السائل ترك الفيروس التي تحتوي على الكريات التي تكاد تكون مرئية كما البقع شفافة صغيرة.
بعد إفراغ المناط قلب الأنابيب على المناشف الورقية للسماح السائل المتبقية لاستنزاف. إضافة 70 لتراً من 1X PBS إلى الأنبوب الأول وماصات جيداً لإعادة تعليق بيليه. نقل التعليق إلى أنبوب المقبل وتكرار مع الأنابيب ونقل حتى يتم إعادة تعليق جميع الكريات.
إضافة 50 ميكرو لتر إضافي من 1X PBS إلى الأنبوب الأول ومزيج لغسله. ثم نقل التعليق إلى أنبوب الثاني لغسل والاستمرار مع الغسيل ونقل كما كان سابقا، مما أسفر عن ما يقرب من 120 لترا من الحليبي تعليق النهائي قليلا. جهاز طرد مركزي في 10000 غرام لمدة 60 ثانية للحصول على تعليق واضح نقل supernatant إلى أنبوب جديد وجعل خمسة ميكرو لتر aliquot وتخزينها في السلبية 80 درجة مئوية مكان كريبوفيال مع MD NPC في كتلة الحرارة 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين ونقل الخلايا المذابة إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر مع 10 ملليلتر من 10MEM-F12 دافئ.
جهاز طرد مركزي في 300 غرام لمدة خمس دقائق. استلهمت من فوق و إعادة تعليق الخلايا في مليلترين من قبل تدفئة كاملة N2B2 المتوسطة. إضافة ملليلترين من N2B27 إلى تعليق الخلية ولوحة مليلترين من الخلايا في كل بئر من BMM أعدت سابقا ستة لوحة جيدا.
احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 بين عشية وضحاها. عندما MD NPCs هي في التقاء 70٪، transduce لهم بإضافة لترين من فيروس العدس دليل رنا د-Cas9-DNMT3A ودوامة بلطف لوحة. بعد احتضان الخلايا في نفس الظروف كما كان سابقا لمدة 16 ساعة استبدال N2B27 المتوسطة 48 ساعة بعد النقل.
إضافة N2B27 مع خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر من Meissen نقية للحصول على خطوط المجلس الوطني الديمقراطي مستقرة، وتنمو الخلايا لمدة ثلاثة أسابيع في N2B27 بالإضافة إلى Meissen نقية لتوصيف ملف تعريف الميثيل من SNCA intron 1. استخراج الحمض النووي أولا من كل خط خلية محول مستقر باستخدام عدة استخراج الحمض النووي، ثم استخدام 800 نانوغرام من الحمض النووي لإجراء تحويل ثنائي الكبريت مع مجموعة متاحة تجاريا ومن ثم تحويل الحمض النووي ثنائي السلفيد إلى 20 نانوغرام لكل لتر صغير. لتحليل تسلسل البيرو إعداد المزيج الرئيسي PCR في نواة أنبوب حر نقل لوحة التفاعل إلى دورة حرارية وبدء PCR.
تصور amplicons باستخدام لترين من الدقيقة من المنتج PCR مع 30 وبروميد تلطيخ بعد Agarose هلام electrophoresis. بالنسبة لمقايسات تسلسل البرواني المستخدمة في خليط من غير الميثيلية والميثيلات بالكبريتيد المحول DNAs والكواشف ذات التسلسل البرواني كما هو موضح في المخطوطة. حساب قيم المثيل لكل موقع CPG باستخدام البيرو تسلسل الإنتاجية المادية لبرنامج العدط d-Cas9-DMMT3A-GFP ناقلات وناقل GFP السذاجة التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول قابلة للمقارنة.
وهذا يشير إلى أن فائدة العمود الفقري للمتجه الأمثل جنبا إلى جنب مع بروتوكول الإنتاج الأمثل النتائج في غلة عالية أكثر إحكاما من ناقلات كريسبر-dCas9 معدلات النقل من ناقلات العدط d-Cas9-DNMT3 GFP ناقلات كان أربع مرات أقل من أن من الناقل GFP السذاجة مما يشير إلى أن كفاءة التعبئة والتغليف من CRISPR د-Cas9-RNA يتم تخفيض. وكانت معدلات النقل من متجه PURO السذاجة خمسة أضعاف أعلى بالمقارنة مع D-Cas9-DNMT3A ناقلات. وقد تأكدت هذه النتائج أيضاً باستخدام برنامج السذاجة GFP و D-Cas9-DNMT3A-GFP.
البروتوكول المستندة إلى EB الموصوف هنا يسمح بالتمايز بين مراكز MD NPCs. أعرب hiPSCs عن علامة قوة المتعة Oct4 في حين يتم التعبير عن MD NPC على حد سواء نستين وفوإكسا2. صُممت سبع عمليات فحص تسلسلية لبيرو وتم التحقق من صحتها لتحديد كمي حالة المثيل في SNCA intron 1.
تم التحقق من صحة جميع 7 المقايسات وأظهرت الارتباط الخطي، وذلك باستخدام المقايسات التحقق من صحة كان من الممكن لتحديد مستويات المثيل في 23 CPGs في إنترون SNCA 1 أهم شيء أن نتذكر من حضور هذا الإجراء هو العمل مع الخلايا التي تظهر النمو السليم والصحة لضمان الاتساق عبر التجارب. إنتاج ناقلات العدس أبرز في هذا العرض يمكن اعتمادها بسهولة لإنتاج التكاملات نقص مكافحة الفيروسات كما أنه يمكن أيضا أن يكون بسهولة توسيع لتوليد كميات أكبر أو ناقلات أكثر تركيزا. هذه التقنية يمكن أن تمهد الطريق لاستكشاف الأثر الممرض للجينات إلغاء التنظيم على العمر ذات الصلة ولا الاضطرابات التوليدية بما في ذلك مرض الزهايمر والخرف ذات الصلة.
ميزة ناقلات العدس تتطور هنا هو أنه ليس خطر أو ليس ناقلات العدس المعدية لها تأثير ضئيل فقط على دورة الخلية انهم منصة تسليم آمنة وموثوق بها لتطبيقات العلاج الجيني.
