يجب إجراء نقل الخلايا HEK293T عند التقاء 90٪. أيضا ، من الضروري استخدام مرشح ربط منخفض البروتين 0.45 ميكرون لترشيح ناقلات الفيروسات الخيطية واستخدام وسادة السكروز للطرد المركزي الفائق. ابدأ بزراعة خلايا HEK293T في وسط DMEM يحتوي على 10٪ FBS و 1X البنسلين الستربتومايسين عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع جو من 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 21٪ من الأكسجين حتى تصل الخلايا إلى 90٪ من التقاء قبل البذر للنقل.
البذور أربع مرات 10 إلى الخلايا الست في 10 ملليلتر من متوسط النمو الكامل في لوحة زراعة الأنسجة 100 ملم وتنمو بين عشية وضحاها في حاضنة زراعة الأنسجة الرطبة مع جو من 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 21٪ من الأكسجين. لكل عملية نقل، قم بتخفيف ملليغرام واحد لكل ملليلتر من مخزون الحمض النووي البلازميدي في ملليلتر واحد من وسائط DMEM الخالية من المصل في أنابيب الطرد المركزي سعة 1.5 ملليلتر باتباع نسبة بلازميدات الدخول والتعبئة كما هو موضح في المخطوطة النصية. دوامة الأنبوب لمدة 10 ثوان وتدور في 10،000 مرات G لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة لجمع.
ثم ، أضف 70 ميكرولتر من ملليغرام واحد لكل محلول مخزون ملليلتر من بولي إيثيلين أمين البوليمر ، أو PEI ، إلى الأنبوب. مرة أخرى ، دوامة وتدور لفترة وجيزة الأنبوب. بالنسبة للنقل القائم على الليبوفيكتامين، قم بتخفيف المتجهات في 500 ميكرولتر من وسائط DMEM الخالية من المصل التي تحتوي على 45 ميكرولتر من الكاشف P المزود في المجموعة.
ثم ، قم بتخفيف 70 ميكرولتر من الكاشف L باستخدام 500 ميكرولتر من نفس الوسط. احتضان كلا الأنبوبين في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم ، امزج محتويات كلا الأنبوبين واحتضنهما في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة للسماح بتكوين معقد.
بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من الحمض النووي PEI أو مجمعات الحمض النووي lipofectamine إلى الصفيحة التي تحتوي على خلايا واحتضان لمدة ست ساعات عند 37 درجة مئوية مع جو من 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 21٪ من الأكسجين. بعد الحضانة ، استبدل الوسائط ب 10 ملليلتر من وسائط النمو الكاملة الجديدة وأعد اللوحة إلى الحاضنة. بعد يومين من النقل ، اجمع الوسائط المحتوية على الفيروس وتراكب الخلايا ب 10 ملليلتر من وسائط النمو الكاملة الطازجة.
مرة أخرى ، بعد ثلاثة أيام من النقل ، قم بجمع الوسائط المحتوية على الفيروس ودمجها مع الوسائط التي تم جمعها في نقطة زمنية مدتها يومان. جهاز الطرد المركزي للغاز الخارق الفيروسي بسرعة 2000 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية لتكسير الحطام الخلوي. قم بتصفية المادة الفائقة باستخدام فلتر منخفض البروتين بحجم 0.45 ميكرون من حجم المسام وتخزينها عند أربع درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للطرد المركزي الفائق.
قم بتعقيم أكواب أنابيب الطرد المركزي عن طريق الغسيل بنسبة 70٪ من الإيثانول لمدة 10 دقائق. تجف الأكواب في الهواء وتغلق وتوضع عند أربع درجات مئوية. أضف 36 ملليلتر في الوسائط المصفاة التي تحتوي على جزيئات فيروسية عدسية إلى أنبوب طرد مركزي فائق معقم.
املأ خمسة ملليلترات من شريط معقم بأربعة ملليلترات من محلول السكروز المعقم بنسبة 20٪ المحضر في PBS وقم بتوزيعه على الجزء السفلي من الأنبوب الذي يحتوي على ناقلات فيروسية ، أو LVS. تأكد من عدم خلط محلول السكروز مع الوسائط ويجعل التدرج في الجزء السفلي من الأنبوب. قم بموازنة جميع أنابيب أجهزة الطرد المركزي الفائقة باستخدام وسائط DMEM الخالية من المصل ، وضع الأنابيب في أكواب حمل أنبوب الطرد المركزي البارد ، وأغلق الأغطية.
تدور الأنابيب عند 125،000 مرة G لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية. بعد الدوران ، تخلص بعناية من supernatant عن طريق عكس محتويات الأنبوب في حاوية تحتوي على التبييض دون إزعاج الكرية. ضع علامة على الكريات إذا كانت مرئية.
ضع أنبوب الطرد المركزي الفائق في أنبوب معقم سعة 50 ملليلتر وأضف 200 ميكرولتر من DPBS المعقم في الجزء العلوي من الكرية. ضع الأنبوب عند أربع درجات مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، امزج بلطف محتوى الأنبوب عن طريق السحب لأعلى ولأسفل قبل الدوران بسرعة 13،000 مرة G في جهاز طرد مركزي على الطاولة لتكسير أي حطام.
نقل supernatant إلى أنبوب جديد و aliquot إعداد الفيروس. أخيرا ، قم بتخزين الأنابيب عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد النقل ، لوحظ تعبير GFP وفير في خلايا HEK293T.
أدى التعبير عن البروتينات الفيروسية إلى تكوين خلايا HEK293T حيث يتم دمج الخلايا المفردة. بعد الإصابة ، لوحظ أيضا تعبير ملحوظ عن GFP في الخلايا السلفية العصبية المصابة بالفيروسات. لم يظهر قياس عيار LVS بين كاشف PEI منخفض التكلفة وكاشف lipofectamine 3000 أي فرق كبير في العيار الفيروسي.
يتم عرض العيار الفيروسي للناقلات القائمة على PLK 0.1 هنا. أظهرت الخلايا المنقولة بالفيروسية أكثر من 80٪ من صلاحية الخلايا مقارنة بالخلايا غير المحولة ، في حين لم تنجو أي خلايا من العلاج. أظهر تحليل اللطخة الغربية تعبيرا وفيرا عن نازعة هيدروجيناز L-2-hydroxyglutarate في الخلايا المنقولة بالعمود الفقري المتجه الفارغ.
ومع ذلك ، لم يلاحظ أي تعبير في الخلايا المنقولة مع متجه يحمل الحمض النووي الريبي القصير دبوس الشعر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي استخدام البوليمر الكاتيوني منخفض التكلفة بولي إيثيلينيمين لإنتاج جزيئات lentiviral عن طريق المشاركة في نقل خلايا HEK293T باستخدام ناقلات الدخول والتعبئة.
