هنا نحن وصف بروتوكول استخدام المناعة الفلورية، والمجهر confocal، والتحليل القائم على الكمبيوتر لتحديد توزيع البروتين متشابك نسبة إلى البروتين المرجعي. طريقتنا يتحايل على التباين المتأصل في تلطيخ الفلور المناعية باستخدام نسبة بدلاً من مستويات الفلورانس المطلقة. بالإضافة إلى ذلك مع هذه الطريقة يمكنك تحليل عدم تجانس توزيع البروتين على مستويات مختلفة.
من شرائح الدماغ بأكملها إلى مناطق الدماغ حتى المناطق الفرعية مثل طبقات مختلفة من قرن آمون. ويمكن تكييف هذه التقنية لتحديد توزيع البروتين في أنسجة مختلفة غير الدماغ ونظم النموذج غير الفئران. ابدأ بغسل دماغ فأر معزول وثابت سابقًا كما هو موضح في المخطوطة.
ثم نقل الدماغ إلى أنبوب تفاعل 15 ملليلتر مع 30٪ سكروز 0.1 PB الضرس. لحماية والتبريد الدماغ احتضانه في 4 درجات مئوية لمدة 48 ساعة أو حتى يغرق. بعد ذلك استخدام شفرة حادة لتقليم الدماغ المحمية التبريد اعتمادا على منطقة الاهتمام. ثم ضع الدماغ في قالب التبريد وإضافة مجمع درجة حرارة القطع الأمثل لتضمينه مع التأكد من تجنب الفقاعات وتوجيه الدماغ بشكل صحيح بحيث يكون لها مستوى من القطع التاجي.
ضع قالب التبريد في الفريزر ناقص 80 درجة مئوية حتى يتم تجميدها الصلبة. قم بتركيب الأنسجة المجمدة على ميكروتوم التبريد وانتظر لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل القسم لتكبيله إلى درجة حرارة الدقيقة. ابدأ في تقطيع الدماغ إلى شرائح إكليلية سميكة 25 ميكرومتر.
استخدم خطاف زجاجي إلى أكتوبر من الشريحة الأولى بعناية دون لمس أنسجة الدماغ. سوف أكتوبر التمسك هوك الزجاج. استخدام ربط الزجاج لنقل شريحة الدماغ في البئر الأول.
جمع ثلاث شرائح المجاورة في بئر في لوحة 24 جيدا مليئة PB 0.1 المول. تخزين شرائح في أربع درجات مئوية حتى تلطيخ لمدة تصل إلى أسبوعين. لإعداد شرائح من دون مُلون استخدام الأنابيب البلاستيكية لإزالة حل PB من واحد جيدا دون رسم في شرائح الدماغ. ثم استخدام 1000 ميكرو لتر pipet لإضافة 250 ميكرولتر من PB الطازجة لغسلها من أكتوبر الزائدة.
كرر هذا الغسيل لكل بئر في ذلك الوقت لتجنب تجفيف الشرائح. ثم، استخدام الأنابيب البلاستيكية لإزالة حل PB من البئر الأول. استخدام 1000 الأنابيب microliter لإضافة 250 microliters من العازلة حظر في العمل بشكل جيد بشكل جيد من قبل جيدا مرة أخرى.
احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة على شاكر لمدة ثلاث ساعات. خلال الحضانة إضافة 250 ميكرولترات من عازلة للجسم المضاد في بئر إلى أنبوب رد فعل. ثم استخدام 2 الأنابيب ميكروليتر لإضافة كمية مناسبة من الأجسام المضادة الأنابيب مباشرة في الحل وباقة الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات لخلط.
ثم دوامة هذا الجسم المضاد المخفف لخلط غير متأكد السليم. تعمل بشكل جيد عن طريق إزالة جيدا العازلة منع مع pipet البلاستيك وإضافة 250 ميكرولترات من حل الأجسام المضادة الأولية في بئر. احتضان لوحة على شاكر في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي إزالة حل الأجسام المضادة مع الأنابيب البلاستيكية. غسل شرائح مع 300 ميكرولترات الغسيل العازلة واحدة في بئر ثلاث مرات عشر دقائق كل غسل على شاكر في درجة حرارة الغرفة. أثناء الغسيل ، والعمل في الظلام ، وتمييع الفلور للجسم المضاد الثاني في أنبوب رد فعل بنفس الطريقة كما فعلت سابقا مع الأجسام المضادة الأولية.
بعد الانتهاء من غسل إزالة العازلة الغسيل مع الأنابيب البلاستيكية وإضافة 250 ميكرولترات من حل الأجسام المضادة الثانوية في بئر. احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة. بعد الانتهاء من الاحتضان إزالة حل الأجسام المضادة مع الأنابيب البلاستيكية.
غسل المقاطع ثلاث مرات مع غسل العازلة اثنين في نفس الطريقة كما هو الحال مع غسل العازلة واحدة. خلال هذا الغسيل تخفيف وصمة عار DAPI في 0.1 PB المول لتحقيق تركيز واحد إلى 2000. بعد إزالة العازلة الغسيل من لوحة إضافة 250 ميكرولترات من حل DAPI واحتضان في درجة حرارة الغرفة على شاكر لمدة 5 دقائق.
بعد إزالة حل DAPI مع الأنابيب البلاستيكية استخدام 1000 الأنابيب ميكرولتر لإضافة 500 ميكرولترات من 0.1 PB المولر في بئر. ضع شريحة مجهر تحت منظار مجسم. استخدام فرشاة غرامة لإضافة ثلاث قطرات منفصلة من 0.1 PB المول على الشريحة.
باستخدام فرشاة مكان شريحة واحدة لكل قطرة على الشريحة ومن ثم تسطيح وتوجيه الشرائح. بعد يتم وضع جميع شرائح بشكل صحيح استخدام نسيج الورق لإزالة PB الزائدة وتجف بعناية دون تجفيف شرائح تماما. ثم إضافة 80 ميكرولترers من تضمين المتوسطة على الشريحة وتغطي بعناية مع زلة غطاء لتضمين شرائح الدماغ.
تغطية الشرائح لتجنب التعرض للضوء وتركها لتجف في غطاء الدخان لمدة ساعة إلى ساعتين ومن ثم تخزينها في مربع شريحة المجهر في أربع درجات مئوية حتى جاهزة للمجهر confocal. بعد الحصول على الأنسجة الظاهرية من شريحة الدماغ كله للقنوات المختلفة كما هو موضح في المخطوطة تحميل جميع القنوات الفردية أو صورة واحدة في فيجي عن طريق النقر على الملف ثم فتح. ثم استخدم أداة اختيار اليد الحرة لتحديد نصف الكرة الأرضية واحد في قناة DAPI.
انقر على تحرير، ثم تحديد، ثم إنشاء قناع لإنشاء قناع للمنطقة المحددة. ثم انقر على تحليل ثم قياس الجسيمات لتحديد شدة الفلورس المتوسط للقنوات الفردية. التأكد من تحديد قنوات مفردة لتحديد متوسط قيم كثافة الفلوريسنس لكل قناة.
بعد ذلك، انسخ متوسط شدة الفلورانس للقنوات المفردة في جدول بيانات. لتحديد متوسط كثافة الفلوريسين للقنوات المفردة في منطقة ذات أهمية، تحدد المنطقة باستخدام أداة اختيار اليد الحرة. بعد تلطيخ مع DAPI التي تلطخ أقسام الدماغ النوى لها نمط منقطة والمناطق ذات كثافة الخلايا العالية هي أكثر إشراقا من المناطق ذات الكثافة منخفضة الخلية.
كشف تلطيخ مع الأجسام المضادة المونتور توزيع غير متجانسة مع مناطق بقعة ساخنة زاهية والمناطق باهتة في جميع أنحاء الدماغ حيث كشفت Synaptophysin توزيع أكثر تجانسا. وأظهر تراكب من الصور التوزيع التفاضلي للفلورس الأحمر تشير إلى البروتين المُحرك مقارنة الفلورسيه الخضراء التي تشير إلى Synaptophysin. بعد تحليل القياس الكمي، تم تحديد قيم كثافة الفلوريسنس لمختلف القنوات عبر نصفي الكرة الأرضية وعبر المناطق ذات الأهمية لكل من المُحرك والسينوبتوفيسين.
وتبين نسب قيم الفلورية للمحرك إلى قيم الفلورية السينيبتوفيسين التوزيع غير المتجانس للمحرك مع مناطق ذات مستويات عالية ومنخفضة من المحرك نسبة إلى السوسين السينوبيك. نسبيّة متحرّر وفرة النسبة في واحدة منطقة الفائدة يقارن إلى أنّ عبر الكرة نصف وأنّ ترجم داخل نسبة مئويّة يبدي كمّ متحرّق يكون حاضرة في واحدة منطقة الفائدة نسبة إلى المعدل. تم تحديد وفرة المحرك النسبية لطبقات مختلفة في الحقول الفرعية من قرن آمون.
ويتم تحديد المناطق الثلاث ذات الأهمية كمياً بمقارنة النسبة في الطبقات المعنية مع نسبة نصف الكرة الأرضية المقابل. ويمكن بسهولة تكييف هذا الإجراء وجنبا إلى جنب مع تقنيات التصوير المختلفة مثل المجهر فائقة الدقة لتحديد بالإضافة إلى ذلك التوزيع الخلوي الفرعي للبروتين من الفائدة. ويمكن أيضا تطبيق هذه التقنية على نظم نماذج مختلفة مثل الحيوانات المعدلة وراثيا أو المعالجة بالعقاقير.
وهذا يمكن أن يسمح لنهج مقارن عبر ظروف تجريبية مختلفة أو حتى الأنواع.
