This work was supported by core facilities of the Center for Translational Neuroscience supported by NIH award P20 GM103425 and P30 GM110702 to Dr. Garcia-Rill. This work was also supported by grants from FONCYT-Agencia Nacional de Promoci&#242;n Cient&#236;fica y Tecnol&#242;gica; BID 1728 OC.AR. PICT-2012-1769 and UBACYT 2014-2017 #20120130101305BA (to Dr. Urbano).

وقد وافق جميع البروتوكولات التجريبية لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة أركنساس للعلوم الطبية (رقم بروتوكول # 3593) وكان في اتفاق مع المعاهد الوطنية للصحة المبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. 1. إعداد السائل النخاعي ستاندرد الاصطناعي (ACSF) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول المخزون ل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 700 مل من الماء المقطر لتنظيف الدورق 1 لتر قبل إضافة المواد الكيميائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع التحريك المستمر لحجم 500 مل، إضافة 136،75 غرام من كلوريد الصوديوم، 6.99 غرام من بوكل، 2.89 غرام من MgSO 4، و2.83 غرام من ناه 2 ص 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الماء المقطر أكثر للوصول إلى الحجم النهائي من 1 L. بعد التخفيف، وتركيز النهائي لكل مركب هو 117 مم كلوريد الصوديوم، 4.69 ملي بوكل، MgSO 1.2 ملي 4، و1.18 ملي ناه 2 ص 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحفظ في الثلاجة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول المخزون B <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 700 مل من الماء المقطر إلى دورق 1L نظيفة قبل إضافة مواد كيميائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع التحريك المستمر لحجم 500 مل، إضافة 41.45 غرام من مد الجلوكوز و41.84 غرام من NaHCO 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الماء المقطر أكثر للوصول إلى الحجم النهائي من 1 L. بعد التخفيف، وتركيز النهائي لكل المركب 11.5 ملي مد الجلوكوز و 24.9 ملم NaHCO 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحفظ في الثلاجة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل كل مزيج تجربة 50 مل من الأسهم ومع 50 مل الأسهم باء ويرتفع الى 1 لتر بالماء المقطر للحصول على النهائي حل تركيز ACSF وترك في RT بينما بالاكسجين بشكل مستمر مع كربوجين (95٪ O 2-5٪ CO 2 مزيج) لمدة 30 دقيقة على الأقل. إعداد ACSF التركيز النهائي فقط في بداية كل تجربة وتجاهل في نهاية اليوم. </li></ol></li></ol> 2. إعداد السائل النخاعي السكروز الاصطناعي(السكروز-ACSF) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول المخزون C <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 700 مل من الماء المقطر لتنظيف الدورق 1 لتر قبل إضافة المواد الكيميائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع التحريك المستمر 500 مل من الماء المقطر، إضافة 240 غرام من السكروز، 6.55 غرام من NaHCO 3، 0.671 غرام من بوكل، 4.88 غرام من MgCl 2، 0.22 غرام من CaCl 2 و 0.21 غرام من حامض الاسكوربيك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الماء المقطر أكثر للوصول إلى الحجم النهائي من 1 L. بعد التخفيف، وتركيز النهائي لكل مركب هو 701.1 ملم السكروز، 78 مم NaHCO 3، 9 ملي بوكل، 24 ملي MgCl 2، 1.5 ملي CaCl 2 و 1.2 ملي حمض الاسكوربيك . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على المخزون حل C في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل كل مزيج التجربة 300 مل من 50 مل من الأسهم C مع 600 مل من الماء المقطر للحصول على حل السكروز-ACSF في التركيز النهائي وترك في RT بينما بالاكسجين بشكل مستمر مع كربوجين (95٪ O 2-5٪ CO 2 مزيج) لمدة 30 دقيقة على الأقل. </li></oل&gt; </li></ol> 3. إعداد شريحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كوب نظيف مع 100 مل محلول السكروز-ACSF في الجليد بينما بالاكسجين مع كربوجين وتحديد درجة الحموضة 7.4 باستخدام مقياس درجة الحموضة مع إضافة بضع قطرات من 0.1 حل M هيدروكسيد الصوديوم (عند درجة الحموضة &lt;7.4) أو 0.1 حل M حمض الهيدروكلوريك (عندما الرقم الهيدروجيني&gt; 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تملأ غرفة قطع من vibratome مع السكروز-ACSF والأوكسجين ذلك. تشغيل نظام التبريد القائم على الجلسرين بالإضافة إلى غرفة القطع وانتظر 15 دقيقة للسماح ليبرد إلى 0-4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران الوليدة (الذين تتراوح أعمارهم بين 9 إلى 12 من البالغين توقيت الحوامل الفئران سبراغ داولي) مع الكيتامين (70 ملغ / كلغ، والملكية الفكرية، واستخدام &lt;50 ميكرولتر الحجم النهائي). عندما الجرو هو الهدوء، انقر نقرا تأكد من أن رد الفعل قرصة الذيل غائب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع رأس الجراء. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع جلد الرأس طوليا من الأمام إلى الخلف باستخدام مشرط شفرة الفولاذ الكربوني، وسحب الجلد إلى الجانبين باستخدام ملقط. قطع العظام التي تغطي الدماغ تحريك الشوريissors أفقيا وإزالته تماما لفضح الدماغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم، وإزالة بسرعة الدماغ باستخدام ملعقة (وضعت في البداية تحت البصلة الشمية من أجل دفع برفق الدماغ من أكثر منقاري نحو المناطق الأكثر الذيلية). دفع بلطف الدماغ إلى الاوكسيجين السائل النخاعي السكروز الاصطناعي تبريد الجليد (السكروز-ACSF). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اجراء خفض مجاور للسهمي على النصف الأيمن (إزالة ما يقرب من ثلث نصف الكرة الأرضية)، والغراء الجانب قلص من الدماغ على قرص معدني من شأنها أن تكون ثابتة مغناطيسيا إلى غرفة قطع من vibroslicer لخفض السهمي 400 ميكرون أقسام تحتوي على نواة pedunculopontine (PPN). حافظ على شرائح PPN في RT لمدة 45 دقيقة قبل خلية كاملة تسجيلات التصحيح المشبك. </li></ol> 4. التذبذبات تسجيلات غاما النطاق في PPN شرائح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد البوتاسيوم غلوكونات الحل داخل الخلايا (عالية-K + الحل) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع فيالجليد كوب نظيف مع 10 مل من الماء المقطر. مع التحريك المستمر إضافة: K + -gluconate، 90.68 ملغم فسفوكرياتين دي تريس الملح، 47.66 HEPES ملغ، 1.5 ملغ EGTA، 40.58 ملغ المغنيسيوم 2+ -ATP، و 4 ملغم الصوديوم + 2 -GTP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة الحموضة إلى 7.3 مع KOH (100 ملي من الماء المقطر). إضافة الماء المقطر للوصول إلى الحجم النهائي من 20 مل. إذا لزم الأمر، وضبط الأسمولية مع السكروز (100 ملي من الماء المقطر) ليكون 280-290 ملي أوزمول. بعد التخفيف، وتركيز النهائي لكل مركب هو 124 ملي K + -gluconate، 10 ملي فسفوكرياتين دي تريس الملح، و 10 ملي HEPES، 0.2 ملي EGTA، 4 مم المغنيسيوم 2+ -ATP، و 0.3 ملي نا + 2 -GTP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلول قسامة داخل الخلايا في 1 مل الأنابيب وتجميد في -20 درجة مئوية. استخدام قسامة واحدة يوميا، والحفاظ على 4 درجات مئوية خلال التجارب. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلية كاملة التصحيح تسجيلات المشبك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع شرائح في غرفة الغمر ويروي لهم (1.5 مل / دقيقة) مع المؤكسد(95٪ O 2-5٪ CO 2) ACSF تحتوي على مستقبلات التالية: انتقائية NMDA مستقبلات حمض 2-أمينو-5-phosphonovaleric (APV، 40 ميكرومتر)، قادرة على المنافسة أمبا / Kainate مستقبلات الغلوتامات خصم 6 cyano-7- nitroquinoxaline-2،3-ديون (CNQX، 10μM)، الجلايسين مستقبلات الإستركنين (STR، 10 ميكرومتر)، وGABA محددة لمستقبلات gabazine (GBZ، 10 ميكرومتر)، والصوديوم قناة مانع سم الأسماك الرباعية الأسنان (TTX، 3μM) ملاحظة: في النتائج والأرقام، ويشار إلى هذه الخصوم جماعي لحاصرات كما متشابك أو الفرعيتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء ماصات تسجيل التصحيح (المقاومة 2-7 MΩ وجعل من، المتاحة تجاريا الشعيرات الدموية العادية سميكة الجدار البورسليكات الزجاج من القطر الخارجي 1.0 ملم و 0.6 ملم القطر الداخلي) مع الحل الخلايا عالية K + باستخدام المتاحة تجاريا الحشو التصحيح، ماصة مع حل التصفية. إدراج ماصة في حامل مكبر للصوت الخاصة به. تطبيق نقاط البيع الصغيرةضغط مبنيا على إيجابية باستخدام حقنة 1 مل متصلا حامل ماصة باستخدام أنبوب السيليكون متصلة ثلاثية صمام. ربط الجزء الخلفي من حامل ماصة للمكبر للصوت المشبك التصحيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل ماصة تسجيل باستخدام micromanipulator الميكانيكية قرب النواة PPN باستخدام الهدف 4X مجتمعة إلى الأشعة تحت الحمراء القريبة تدخل الفرق النقيض البصريات. ملاحظة: PPN نواة يمكن ملاحظتها في شرائح ظهري إلى السويقة المخيخية العلوية (SCP، يمكن ملاحظتها كحزمة واحدة سميكة من محاور عصبية). وتقع الماصات تسجيل في PPN بارس المكتنزة، والذي يقع مباشرة الظهرية إلى نهاية الخلفية للساق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب ماصة تسجيل في اتصال مع الخلايا العصبية PPN بينما تصور باستخدام عدسة الغمر 40X المياه، وتطبيق بسرعة شفط سلبي على شكل خاتم مع الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الجهد المشبك البرمجيات ختم لمراقبة المقاومة ماصة أثناء شفط سلبي باستخدام بروتوكول الشركة الصانعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما الصورة السلبيةيتم زيادة uction ببطء والقيم مقاومة قراءة بواسطة جهاز العرض التصحيح، المشبك على طرف ماصة تصل إلى 80-100 MOHM، بسرعة تغيير إمكانية عقد ل-50 بالسيارات والافراج عن الضغط السلبي. بدء تطبيق باستمرار شفط سلبي حتى تمزق غشاء يتحقق والكهربائية وصول الخلايا العصبية في تكوين خلية كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا قيم المقاومة وصول تقاس بواسطة برنامج ختم الجهد المشبك هي 10 MOHM أو أعلى، ثم مواصلة تطبيق شفط سلبي في كميات صغيرة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعويض السعة (أي، لاحظ العابرين بطيء وسريع بعد تمزق غشاء الخلية) وسلسلة المقاومة في وضع الجهد المشبك. تبديل طريقة لتسجيل المشبك الحالي، وبسرعة تعويض القيم جسر (على سبيل المثال، نقل مكبر للصوت مقبض الباب أو انقر على قائمة التعويض التلقائي باستخدام الماوس جهاز الكمبيوتر؟). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رصد مستمر يستريح غشاء المحتملة من PPN الخلايا العصبية التي سجلت شالغناء بروتوكول الشركة الصانعة. إذا يستريح غشاء تحول محتمل نحو depolarizing أو hyperpolarizing القيم، ثم استخدام كميات صغيرة من التيار المباشر (ما يصل إلى 100 سنويا) للحفاظ على بالسيارات القيمة النهائية المثلى -50. ملاحظة: حافظ على الخلايا العصبية PPN الوحيدة مع مستقرة إمكانات غشاء يستريح (RMP) من -48 بالسيارات أو أكثر hyperpolarized (أي RMP &lt;-48 بالسيارات). </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Profice, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurophysiological+evaluation+of+the+pedunculopontine+nucleus+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural.+Transm+%28Vienna%29%22%5BJournal%5D)">Neurophysiological evaluation of the pedunculopontine nucleus in humans.</a> J. Neural. Transm (Vienna). 118 (10), 1423-1429 (2011).</li>
<li>Steriade, M., Datta, S., Pare, D., Oakson, G., Curro Dossi, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activities+in+brain-stem+cholinergic+nuclei+related+to+tonic+activation+processes+in+thalamocortical+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal activities in brain-stem cholinergic nuclei related to tonic activation processes in thalamocortical systems.</a> J. Neurosci. 10 (8), 2541-2559 (1990).</li>
<li>Steriade, M., Dossi, R. C., Pare, D., Oakson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+oscillations+%2820-40+Hz%29+in+thalamocortical+systems+and+their+potentiation+by+mesopontine+cholinergic+nuclei+in+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fast oscillations (20-40 Hz) in thalamocortical systems and their potentiation by mesopontine cholinergic nuclei in the cat.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (10), 4396-4400 (1991).</li>
<li>Deurveilher, S., Hennevin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lesions+of+the+pedunculopontine+tegmental+nucleus+reduce+paradoxical+sleep+%28PS%29+propensity%3A+evidence+from+a+short-term+PS+deprivation+study+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lesions of the pedunculopontine tegmental nucleus reduce paradoxical sleep (PS) propensity: evidence from a short-term PS deprivation study in rats.</a> Eur. J. Neurosci. 13 (10), 1963-1976 (2001).</li>
<li>Steriade, M., Pare, D., Datta, S., Oakson, G., Curro Dossi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+cellular+types+in+mesopontine+cholinergic+nuclei+related+to+ponto-geniculo-occipital+waves%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Different cellular types in mesopontine cholinergic nuclei related to ponto-geniculo-occipital waves.</a> J. Neurosci. 10 (8), 2560-2579 (1990).</li>
<li>Steckler, T., Inglis, W., Winn, P., Sahgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pedunculopontine+tegmental+nucleus%3A+a+role+in+cognitive+processes%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">The pedunculopontine tegmental nucleus: a role in cognitive processes?</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 19 (3), 298-318 (1994).</li>
<li>Garcia-Rill, E., Simon, C., Smith, K., Kezunovic, N., Hyde, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pedunculopontine+tegmental+nucleus%3A+from+basic+neuroscience+to+neurosurgical+applications%3A+arousal+from+slices+to+humans%3A+implications+for+DBS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural.+Transm%22%5BJournal%5D)">The pedunculopontine tegmental nucleus: from basic neuroscience to neurosurgical applications: arousal from slices to humans: implications for DBS.</a> J. Neural. Transm. 118 (10), 1397-1407 (2011).</li>
<li>Mazzone, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+human+pedunculopontine+nucleus%3A+a+safe+and+clinically+relevant+target+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Implantation of human pedunculopontine nucleus: a safe and clinically relevant target in Parkinson's disease.</a> Neuroreport. 16 (17), 1877-1881 (2005).</li>
<li>Simon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+band+unit+activity+and+population+responses+in+the+pedunculopontine+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Gamma band unit activity and population responses in the pedunculopontine nucleus.</a> J. Neurophysiol. 104 (1), 463-474 (2010).</li>
<li>Kezunovic, N., Urbano, F. J., Simon, C., Hyde, J., Smith, K., Garcia-Rill, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+behind+gamma+band+activity+in+pedunculopontine+nucleus+%28PPN%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanism behind gamma band activity in pedunculopontine nucleus (PPN).</a> Eur. J. Neurosci. 34 (3), 404-415 (2011).</li>
<li>Hyde, J. R., Kezunovic, N., Urbano, F. J., Garcia-Rill, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+properties+of+high+speed+calcium+oscillations+in+the+pedunculopontine+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal properties of high speed calcium oscillations in the pedunculopontine nucleus.</a> J. Appl. Physiol (1985). 115 (9), 1402-1414 (2013).</li>
<li>Llinas, R. R., Leznik, E., Urbano, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+binding+via+cortical+coincidence+detection+of+specific+and+nonspecific+thalamocortical+inputs%3A+a+voltage-dependent+dye-imaging+study+in+mouse+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Temporal binding via cortical coincidence detection of specific and nonspecific thalamocortical inputs: a voltage-dependent dye-imaging study in mouse brain slices.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (1), 449-454 (2002).</li>
<li>Boucetta, S., Cisse, Y., Mainville, L., Morales, M., Jones, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discharge+profiles+across+the+sleep-waking+cycle+of+identified+cholinergic%2C+gabaergic%2C+and+glutamatergic+neurons+in+the+pontomesencephalic+tegmentum+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Discharge profiles across the sleep-waking cycle of identified cholinergic, gabaergic, and glutamatergic neurons in the pontomesencephalic tegmentum of the rat.</a> J. Neurosci. 34 (13), 4708-4727 (2014).</li>
<li>Datta, S., Siwek, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+activity+patterns+of+pedunculopontine+tegmentum+neurons+across+the+sleep-wake+cycle+in+the+freely+moving+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Single cell activity patterns of pedunculopontine tegmentum neurons across the sleep-wake cycle in the freely moving rats.</a> J. Neurosci. Res. 70 (4), 79-82 (2002).</li>
<li>Datta, S., Siwek, D. F., Stack, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cholinergic+and+non-cholinergic+neurons+in+the+pons+expressing+phosphorylated+cyclic+adenosine+monophosphate+response+element-binding+protein+as+a+function+of+rapid+eye+movement+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of cholinergic and non-cholinergic neurons in the pons expressing phosphorylated cyclic adenosine monophosphate response element-binding protein as a function of rapid eye movement sleep.</a> Neuroscience. 163 (1), 397-414 (2009).</li>
<li>Kayama, Y., Ohta, M., Jodo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firing+of+%27possibly%27+cholinergic+neurons+in+the+rat+laterodorsal+tegmental+nucleus+during+sleep+and+wakefulness%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Firing of 'possibly' cholinergic neurons in the rat laterodorsal tegmental nucleus during sleep and wakefulness.</a> Brain Res. 569 (2), 210-220 (1992).</li>
<li>Sakai, K., El Mansari, M., Jouvet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+by+carbachol+microinjections+of+presumptive+cholinergic+PGO-on+neurons+in+freely+moving+cats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition by carbachol microinjections of presumptive cholinergic PGO-on neurons in freely moving cats.</a> Brain Res. 527 (2), 213-223 (1990).</li>
<li>Lindsley, D. B., Bowden, J. W., Magoun, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+upon+the+EEG+of+acute+injury+to+the+brainstem+activating+system%5BTitle%5D)+AND+%22Electroenceph.+Clin.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Effect upon the EEG of acute injury to the brainstem activating system.</a> Electroenceph. Clin. Neurophysiol. 1 (4), 475-486 (1949).</li>
<li>Moruzzi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sleep-waking+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Ergeb.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The sleep-waking cycle.</a> Ergeb. Physiol. 64, 1-165 (1972).</li>
<li>Moruzzi, G., Magoun, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+stem+reticular+formation+and+activation+of+the+EEG%5BTitle%5D)+AND+%22Electroenceph.+Clin.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Brain stem reticular formation and activation of the EEG.</a> Electroenceph. Clin. Neurophysiol. 1 (4), 455-473 (1949).</li>
<li>Steriade, M., Constantinescu, E., Apostol, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlations+between+alterations+of+the+cortical+transaminase+activity+and+EEG+patterns+of+sleep+and+wakefulness+induced+by+brainstem+transections%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Correlations between alterations of the cortical transaminase activity and EEG patterns of sleep and wakefulness induced by brainstem transections.</a> Brain Res. 13 (1), 177-180 (1969).</li>
<li>Ishibashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orexin+receptor+activation+generates+gamma+band+input+to+cholinergic+and+serotonergic+arousal+system+neurons+and+drives+an+intrinsic+Ca2%2B+-dependent+resonance+in+LDT+and+PPT+cholinergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Neurol%22%5BJournal%5D)">Orexin receptor activation generates gamma band input to cholinergic and serotonergic arousal system neurons and drives an intrinsic Ca2+ -dependent resonance in LDT and PPT cholinergic neurons.</a> Frontiers Neurol. 6, e120(2015).</li>
<li>Brown, R. E., Winston, S., Basheer, R., Thakkar, M. M., McCarley, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+neurons+in+the+dorsolateral+pontine+REM+sleep+induction+zone+of+the+rat%3A+intrinsic+membrane+properties+and+responses+to+carbachol+and+orexins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of neurons in the dorsolateral pontine REM sleep induction zone of the rat: intrinsic membrane properties and responses to carbachol and orexins.</a> Neuroscience. 143 (3), 739-755 (2006).</li>
<li>Goetz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+role+of+the+pedunculopontine+nucleus+and+mesencephalic+reticular+formation+in+locomotion+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On the role of the pedunculopontine nucleus and mesencephalic reticular formation in locomotion in non-human primates.</a> J. Neurosci. 36 (18), 4917-4929 (2016).</li>
<li>Fraix, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pedunculopontine+nucleus+area+oscillations+during+stance%2C+stepping+and+freezing+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Pedunculopontine nucleus area oscillations during stance, stepping and freezing in Parkinson's disease.</a> PLOS ONE. 8 (12), e83919(2013).</li>
<li>Luster, B., Hyde, J., D'Onofrio, S., Urbano, F. J., Garcia-Rill, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+behind+gamma+band+activity+in+the+pedunculopontine+nucleus+%28PPN%29%5BTitle%5D)+AND+%22Abstr+Soc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms behind gamma band activity in the pedunculopontine nucleus (PPN).</a> Abstr Soc Neurosci. 38, 257.20(2014).</li>
<li>Luster, B., D'Onofrio, S., Urbano, F. J., Garcia-Rill, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-threshold+Ca2%2B+channels+behind+gamma+band+activity+in+the+pedunculopontine+nucleus+%28PPN%29%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rep%22%5BJournal%5D)">High-threshold Ca2+ channels behind gamma band activity in the pedunculopontine nucleus (PPN).</a> Physiol. Rep. 3 (6), e12431(2015).</li>
</ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

الخلايا العصبية PPN لها خصائص الجوهرية التي تسمح لهم لاطلاق النار إمكانات العمل على ترددات الموجات بيتا / غاما خلال في الجسم الحي تسجيلات من الحيوانات التي هي مستيقظا أو أثناء النوم REM، ولكن ليس أثناء بطيئة موجة النوم 2،3،5،13-17. وقد أظهر مؤلفين آخرين أن transections الدماغ في أكثر من مستويات الأمامي من PPN تخفيض الترددات جاما خلال تسجيلات EEG. ومع ذلك، عندما الخلفي آفات الدماغ إلى حيث يوجد هذه النواة، والتحفيز المباشر من PPN يسمح مظهر من مظاهر النشاط جاما القشرية على EEG 2،3،5،18-21. وقد أبلغ جاما الفرقة النشاط العصبي في الماوس PPN في المختبر 22، في الفئران REM منطقة النوم الاستقراء (الذي PPN مشاريع 23)، في القط في الجسم الحي 3، في منطقة PPN في المقدمات عندما locomoting 24، و في منطقة PPN في البشر خلال يخطو 25. وهذا هو، وهناك أدلة وافرة للنشاط الفرقة جاما طن PPN عبر الأنواع. هذا البروتوكول التجريبي مفصلة هنا يسمح وصف التذبذبات جاما في جميع أنواع الفئران خلية PPN 10. في الواقع، وقد وصفت الآليات الجوهرية التذبذبات جاما الأساسية ليكون حاضرا في كل الخلايا العصبية PPN (في حين أن الخلايا في جميع أنحاء PPN لا يشاركهم هذا العقار)، بغض النظر عن التصنيفات المستخدمة السابقة أو متشابك نوع الارسال: النوع الأول والثاني، أو الثالث، أو الارسال نوع، الكوليني، glutamatergic أو GABAergic يشتركون في نفس جاما الفرقة توليد الملكية 10. استخدام سلالم الحالية لديه الحد من تتطلب المراقبة المستمرة ليستريح غشاء المحتملة، والتعويض جسر دائم في كافة مراحل التجربة. في بعض الحالات، لوحظ سلالم أقصر من 1 ثانية ليست واضحة تماما تنشيط قنوات الكالسيوم الجهد مسور، في حين مدد المنحدر من 5 ثانية أو لفترة أطول أسفرت التغييرات مقاومة الغشاء الذي سيبقى امعاوض أثناء التجربة. في حالة نس لوحظت التذبذبات غاما، تعديلات صغيرة في مدة منحدر يمكن أن يعزز الفرقة جاما سعة التذبذب. الجمع بين depolarizing سلالم الحالية مع السموم محددة وصفناها أن في نسبة هامة من خلايا PPN (~ 50٪) حجب N-وP / Q-نوع (باستخدام كل ω-CgTx وω-الآغا) قنوات قنوات الكالسيوم خفض التذبذب جاما السعة، والتي تسمح لنا أن تصنف على أنها P / ** ووالخلايا N-نوع. في الخلايا الأخرى (20٪)، والتذبذبات جاما الوحيدة التي أصابها أوم-الآغا، مما يشير إلى أن هذه الخلايا أعربت قنوات فقط P / Q-نوع. في بقية الخلايا (30٪) فقط ω-CgTx بحظره، مما يشير إلى كان لهذه الخلايا العصبية PPN فقط قنوات N-نوع. وأكدت هذه النتائج وجود خلايا في PPN أن تظهر التذبذبات الفرقة جاما من خلال التعبير عن مختلف قنوات الكالسيوم الجهد بوابات 26،27. ويمكن أيضا أن يعتبر هذا البروتوكول الجديد أداة رئيسية أن يسمح إدخال خلية الطباع PPN جديدتصنيف البريد إلى الميدان. في الواقع، فقد قيل أن N-نوع فقط الخلايا العصبية PPN النار إلا أثناء النوم REM ( &quot;REM على&quot;)، P / Q-نوع فقط أثناء اليقظة ( &quot;استيقظوا على&quot;)، أو N-نوع + P / Q-النوع خلال كل من الاستيقاظ والنوم REM ( &quot;ويك / REM على&quot;) 26،27. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول في التجارب المستقبلية لوصف النشاط متذبذبة في مناطق أخرى من الدماغ وإظهار الخصائص الجوهرية التسبب لهم.

وتشريحيا وشملت PPN نواة في سقيفة الدماغ المتوسط ​​الذيلية. وPPN هو عنصر أساسي من RAS 1. تشارك PPN في صيانة دول تنشيط السلوكية (أي الاستيقاظ والنوم REM) 2. التحفيز الكهربائي للPPN في الجسم الحي يتسبب التذبذب السريع (20 - 40 هرتز) في EEG القشرية 3، في حين الآفات PPN الثنائية في الفئران خفض أو القضاء REM النوم 4. في حين أن الغالبية العظمى من الخلايا العصبية PPN النار إمكانات العمل في تردد بيتا / غاما النطاق (20-80 هرتز)، وبعض الخلايا العصبية قدمت انخفاض معدلات اطلاق النار التلقائي (&lt;10 هرتز) 5. وعلاوة على ذلك، يبدو أن PPN أن تشارك في جوانب أخرى من السلوك مثل الحافز والاهتمام 6. ارتفاع وتيرة المباشر (40 - 60 هرتز) 7 التحفيز الكهربائي للPPN نواة في الحيوانات فصل الدماغ يمكن أن تعزز الحركة. في السنوات الأخيرة، وقد تم استخدام التحفيز العميق للدماغ (DBS) من PPN لعلاج المرضى الذين يعانون جيئة وذهابااضطرابات م التي تنطوي على العجز المشية مثل مرض باركنسون (PD) 8. وأظهرت تقارير سابقة أن ما يقرب من جميع الخلايا العصبية PPN يمكن اطلاق النار إمكانات العمل في نطاق التردد جاما عندما استقطابها باستخدام النبضات الحالية مربع 9. بسبب تفعيل جذري للقنوات البوتاسيوم الجهد مسور خلال النبضات اللاإستقطابات depolarizations مربع تصل إلى أو تحت -25 بالسيارات. ونتيجة لذلك، لم يلاحظ أي اهتزازات جاما قوية بعد منع توليد إمكانات العمل باستخدام سم الأسماك الرباعية الأسنان 10. في محاولة لتجاوز هذه المشكلة، 1 - استخدمت 2 ثانية depolarizing طويلة سلالم الحالية. استقطابها سلالم تدريجيا غشاء المحتملة من الراحة القيم يصل إلى 0 بالسيارات، بينما تعطيل جزئيا قنوات البوتاسيوم الجهد مسور. كانت واضحة التذبذبات غشاء الفرقة جاما واضحة ضمن إطار الاعتماد الجهد قنوات الكالسيوم عالية العتبة (أي بين -25 بالسيارات و-0 بالسيارات) 10. وفي الختام، والفرقة جاما activiوقد لوحظ تاي في الخلايا العصبية PPN 9، وكلا P / ** ووN-نوع قنوات الكالسيوم الجهد بوابات تحتاج إلى تنشيط من أجل توليد ذبذبات الموجات جاما في PPN 10. سلسلة من الدراسات حددت موقع قنوات عالية من الكالسيوم في الخلايا العصبية عتبة PPN. حقن مزيج من الأصباغ، وأظهر ratiometric التصوير مضان العابرين الكالسيوم من خلال قنوات الكالسيوم الجهد بوابات التي يتم تفعيلها في التشعبات المختلفة عندما استقطابها باستخدام سلالم الحالي 11. وقد اقترحت الخصائص الذاتية للخلايا العصبية PPN للسماح تفعيل المتزامن لهذه الخلايا أثناء اليقظة والنوم REM، مما يحفز عالية التردد متذبذبة نشاط الخلايا العصبية بين RAS والحلقات مهادية قشرية. ويعتبر هذا التفاعل الوصول إلى فترة طويلة لدعم دولة الدماغ قادرة على تقييم موثوق العالم من حولنا بشكل مستمر 12. هنا، نحن تصف التجربةالشروط آل اللازمة لتوليد والحفاظ جاما الفرقة التذبذب في الخلايا PPN في المختبر. لم يتم وصف هذا البروتوكول في وقت سابق، وسيساعد عددا من المجموعات لدراسة خصائص الغشاء الجوهرية التوسط النشاط الفرقة غاما في مناطق أخرى من الدماغ. وعلاوة على ذلك، قد تؤدي الخطوات الحالية إلى الاستنتاج الخاطئ بأن نشاط الفرقة غاما لا يمكن أن تتولد في هذه الخلايا.

<table><tbody><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td>C&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;22&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;, molecular weight = 342.30</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, molecular weight = 84.01</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>KCl, molecular weight = 74.55</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;middot; 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, molecular weight =&amp;nbsp; 203.30</td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;middot; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, molecular weight =147.02</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;, molecular weight = 180.16</td></tr><tr><td>L-Ascorbic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td>C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;, molecular weight =176.12</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Acros Organics</td><td>327300025</td><td>NaCl, molecular weight =&amp;nbsp; 58.44</td></tr><tr><td>Potassium Gluconate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td>C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;KO&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;, molecular weight =&amp;nbsp; 234.25</td></tr><tr><td>Phosphocreatine di(tris) salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1937</td><td>C&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;P &amp;middot; 2C&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, molecular weight =&amp;nbsp; 453.38</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>C&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;S, molecular weight = 238.30</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0396</td><td>[-CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;OCH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;N(CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;]&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, molecular weight = 380.40</td></tr><tr><td>Adenosine 5&#039;-triphosphate magnesium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>&amp;nbsp;C&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;16&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;13&lt;/sub&gt;P&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; &amp;middot; xMg2+, molecular weight = 507.18</td></tr><tr><td>Guanosine 5&#039;-triphosphate sodium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>C&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;16&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;14&lt;/sub&gt;P&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; &amp;middot; xNa+, molecular weight = 523.18</td></tr><tr><td>Tetrodotoxin citrate</td><td>Alomone Labs</td><td>T-550</td><td>C&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;17&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;, molecular weight = 319.27</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;DL-2-Amino-5-Phosphonovaleric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td>&amp;nbsp;C&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;NO&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;P, molecular weight = 197.13</td></tr><tr><td>CNQX disodium salt hydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C239</td><td>C&lt;sub&gt;9&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;middot; xH2O, molecular weight = 276.12</td></tr><tr><td>Strychnine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0532</td><td>C&lt;sub&gt;21&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;22&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, molecular weight = 334.41</td></tr><tr><td>Mecamylamine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9020</td><td>&amp;nbsp;C&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;21&lt;/sub&gt;N &amp;middot; HCl, molecular weight = 203.75</td></tr><tr><td>Gabazine (SR-95531)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S106</td><td>C&lt;sub&gt;15&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt;BrN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, molecular weight = 368.23</td></tr><tr><td>Ketamine hydrochloride</td><td>Mylan</td><td>67457-001-00</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse E600FN</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>ROE-200</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>A/D converter</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Heater</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Pump</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex L/S 7519-20</td><td></td></tr><tr><td>Pump cartridge</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex 7519-85</td><td></td></tr><tr><td>Pipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Q-Imaging</td><td>RET-200R-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>&amp;nbsp;Leica VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>Refrigeration system</td><td>Vibratome Instruments</td><td>900R</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse E600FN</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>ROE-200</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>A/D converter</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>heater</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>pump</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex L/S 7519-20</td><td></td></tr><tr><td>pump cartridge</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex 7519-85</td><td></td></tr><tr><td>pipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>camera</td><td>Q-Imaging</td><td>RET-200R-F-M-12-C</td><td></td></tr></tbody></table>

recording gamma band oscillations in pedunculopontine nucleus neurons

ومن المعروف efferents متشابك من PPN لتعديل نشاط الخلايا العصبية من عدة مناطق مهادي داخل الصفيحة (على سبيل المثال، centrolateral / parafascicular، الكلور / الجبهة الوطنية النواة). وقد وصفت تفعيل إما PPN أو نوى الكلورين / الجبهة الوطنية في الجسم الحي للحث على الإثارة من الحيوان وزيادة في النشاط الفرقة جاما في الكهربائي القشري (EEG). الآليات الخلوية لتوليد اهتزازات الفرقة جاما في نظام شبكي تفعيل (RAS) الخلايا العصبية هي نفس تلك التي وجدت لتوليد اهتزازات الفرقة جاما في نوى العقول الأخرى. خلال تسجيلات المشبك الحالي من الخلايا العصبية PPN (من شرائح سهمي من 9 - الفئران من العمر اليوم 25)، واستخدام depolarizing الخطوات مربع تفعيل بسرعة قنوات البوتاسيوم التي تعتمد على الجهد الذي يمنع الخلايا العصبية PPN من يتم استقطابها وراء -25 بالسيارات. حقن 1-2 ثانية depolarizing طويلة سلالم الحالية استقطابها تدريجيا PPN غشاء الدقة المحتملةتقدر تينغ باتجاه 0 بالسيارات. ومع ذلك، ولدت عن طريق الحقن depolarizing البقول مربع التذبذبات غاما عصابة من غشاء المحتملة التي أظهرت أن تكون أصغر في السعة مقارنة مع التذبذبات التي تم إنشاؤها بواسطة سلالم. أجريت جميع التجارب في وجود قنوات الصوديوم الجهد بوابات وسريعة مستقبلات متشابك حاصرات. ولقد ثبت أن تفعيل قنوات الكالسيوم التي تعتمد على الجهد العالي عتبة تكمن وراء جاما الموجات النشاط متذبذبة في الخلايا العصبية PPN. وصفت التدخلات المنهجية والدوائية محددة هنا، وتوفير الأدوات اللازمة للحث والحفاظ PPN دون العتبي التذبذب الفرقة جاما في المختبر.

في البداية، كان أثار التذبذبات جاما باستخدام النبضات الحالية مربع. تم رصد تسجيل المشبك الحالي من الخلايا العصبية PPN بحضور حاصرات متشابك وTTX بشكل مستمر للتأكد من أن يستريح غشاء المحتملة أبقى مستقرا عند ~ -50 بالسيارات (الشكل 1A). تم حقن اثنين من البقول الحالية مربع طويلة الثانية داخل الخلية بواسطة مكبر للصوت المشبك التصحيح من خلال ماصة تسجيل، وزيادة السعة الخاصة بهم من 200 إلى 600 السلطة الفلسطينية السلطة الفلسطينية (الشكل 1A). تم استقطابها غشاء المحتملة إلى مستويات الجهد أقرب إلى -20 بالسيارات عند 600 السلطة الفلسطينية، مما أدى صغيرة التذبذبات السعة جاما. عرض القوى أطياف التذبذبات غاما القيم السعة صغيرة جدا (أي، &lt;0.01، الشكل 1B). من ناحية أخرى، تم حقن اثنين سلالم الحالية depolarizing الثاني داخل الخلية بواسطة مكبر للصوت المشبك التصحيح من خلال ماصة تسجيل، وتوليد ذبذبات جاما قوية(الشكل 2A) التي قدمت سعة طاقة أعلى من ذلك بكثير (الشكل 2B). العمل السابق 10 ربطت الخلافات بين الساحة ومنحدر البروتوكولات الحالية في تفعيل سلسلة من قنوات البوتاسيوم الجهد مسور خلال الاستقطاب مفاجئ من السابق. سلالم depolarizing بطيئة بدلا من ذلك قد يتم تعطيل قنوات البوتاسيوم. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54685/54685fig1.jpg" /> الشكل 1. غشاء التذبذبات في كامل الخلية سجلت PPN الخلايا العصبية باستخدام ساحة الحالي البقول من زيادة السعة. الردود (A) الممثل غشاء المحتملة لdepolarizing 2 ثانية الخطوات مربع طويلة لزيادة السعة حقن داخل الخلية بواسطة مكبر للصوت المشبك التصحيح من خلال ماصة تسجيل، بحضور حاصرات متشابك وTTX. (ب) تداخلوقد تم الحصول على سعة أطياف الطاقة للالتذبذبات التي تم الحصول عليها باستخدام نبضات مربع هو مبين في A. الطاقة الأطياف باستخدام وظيفة نافذة المبالغة بعد 20-60 هرتز التذبذبات تصفية ممر الموجة الناتجة عن الخطوات depolarizing. وسجلت PPN الخلايا العصبية في تكوين المشبك الحالي الجمع بين ارتفاع K-+ حل داخل الخلايا وحاصرات متشابك + وصف TTX في البروتوكول. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54685/54685fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54685/54685fig2.jpg" /> الشكل 2. غاما الفرقة غشاء التذبذبات في كامل الخلية المسجلة الخلايا العصبية PPN باستخدام سلالم الحالية لزيادة السعة. الردود (A) الممثل غشاء المحتملة لdepolarizing 2 ثانية سلالم طويلة حقنها بواسطة مكبر للصوت المشبك التصحيح داخل الخلية عن طريق تسجيل ماصة، وتظهر. جي زيادة السعة في وجود حاصرات متشابك وTTX (ب) تداخل سعة أطياف الطاقة للالتذبذبات التي تم الحصول عليها باستخدام سلالم هو مبين في A. الطاقة الأطياف تم الحصول عليها باستخدام وظيفة نافذة المبالغة بعد 20-60 هرتز التذبذبات تصفية ممر الموجة المتولدة عن منحدر depolarizing . وسجلت PPN الخلايا العصبية في تكوين المشبك الحالي الجمع بين ارتفاع K-+ حل داخل الخلايا وحاصرات متشابك + وصف TTX في البروتوكول. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54685/54685fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons at JoVE.com

Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons

يقع نواة pedunculopontine (PPN) في الدماغ ويتم تنشيط الخلايا العصبية في الحد الأقصى أثناء اليقظة وحركة العين السريعة (REM) النوم الدماغ الدول. يصف هذا العمل المنهج التجريبي لتسجيل في المختبر الفرقة جاما التذبذب غشاء دون العتبي في الخلايا العصبية PPN.

تسجيل غاما التذبذبات الفرقة في Pedunculopontine نواة الخلايا العصبية

Synaptic efferents from the PPN are known to modulate the neuronal activity of several intralaminar thalamic regions (e.g., the ...

recording-gamma-band-oscillations-in-pedunculopontine-nucleus-neurons

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.6K Views.  University of Buenos Aires.  يقع نواة pedunculopontine (PPN) في الدماغ ويتم تنشيط الخلايا العصبية في الحد الأقصى أثناء اليقظة وحركة العين السريعة (REM) النوم الدماغ الدول. يصف هذا العمل المنهج التجريبي لتسجيل في المختبر الفرقة جاما التذبذب غشاء دون العتبي في الخلايا العصبية ...

Video: Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

الفسيولوجية والمورفولوجية وتوصيف الكيميائية العصبية من الخلايا العصبية عن طريق التضمين الحركة

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Automatic Detection of Highly Organized Theta Oscillations in the Murine EEG

Theta activity is generated in the septohippocampal system and can be recorded using deep intrahippocampal electrodes and implantable electroencephalography (EEG) radiotelemetry or tether system approaches. Pharmacologically, hippocampal theta is heterogeneous (see dualistic theory) and can be differentiated into type I and type II theta. These individual EEG subtypes are related to specific cognitive and behavioral states, such as arousal, exploration, learning and memory, higher integrative functions, etc. In neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#39;s, structural and functional alterations of the septohippocampal system can result in impaired theta activity/oscillations. A standard quantitative analysis of the hippocampal EEG includes a Fast-Fourier-Transformation (FFT)-based frequency analysis. However, this procedure does not provide details about theta activity in general and highly-organized theta oscillations in particular. In order to obtain detailed information on highly-organized theta oscillations in the hippocampus, we have developed a new analytical approach. This approach allows for time- and cost-effective quantification of the duration of highly-organized theta oscillations and their frequency characteristics.

Theta activity in the hippocampus is related to specific cognitive and behavioral stages. Here, we describe an analytical method to detect highly-organized theta oscillations within the hippocampus using a time-frequency (i.e., wavelet analysis)-based approach.

الكشف التلقائي من التذبذبات ثيتا درجة عالية من التنظيم في الفئران EEG

Theta activity is generated in the septohippocampal system and can be recorded using deep intrahippocampal electrodes and implantable ...

Behavior

Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses

In vivo recordings from single neurons allow an investigator to examine the firing properties of neurons, for example in response to sensory stimuli. Neurons typically receive multiple excitatory and inhibitory afferent and/or efferent inputs that integrate with each other, and the ultimate measured response properties of the neuron are driven by the neural integrations of these inputs. To study information processing in neural systems, it is necessary to understand the various inputs to a neuron or neural system, and the specific properties of these inputs. A powerful and technically relatively simple method to assess the functional role of certain inputs that a given neuron is receiving is to dynamically and reversibly suppress or eliminate these inputs, and measure the changes in the neuron's output caused by this manipulation. This can be accomplished by pharmacologically altering the neuron's immediate environment with piggy-back multibarrel electrodes. These electrodes consist of a single barrel recording electrode and a multibarrel drug electrode that can carry up to 4 different synaptic agonists or antagonists. The pharmacological agents can be applied iontophoretically at desired times during the experiment, allowing for time-controlled delivery and reversible reconfiguration of synaptic inputs. As such, pharmacological manipulation of the microenvironment represents a powerful and unparalleled method to test specific hypotheses about neural circuit function.
Here we describe how piggy-back electrodes are manufactured, and how they are used during in vivo experiments. The piggy-back system allows an investigator to combine a single barrel recording electrode of any arbitrary property (resistance, tip size, shape etc) with a multibarrel drug electrode. This is a major advantage over standard multi-electrodes, where all barrels have more or less similar shapes and properties. Multibarrel electrodes were first introduced over 40 years ago 1-3, and have undergone a number of design improvements 2,3 until the piggy-back type was introduced in the 1980s 4,5. Here we present a set of important improvements in the laboratory production of piggy-back electrodes that allow for deep brain penetration in intact in vivo animal preparations due to a relatively thin electrode shaft that causes minimal damage. Furthermore these electrodes are characterized by low noise recordings, and have low resistance drug barrels for very effective iontophoresis of the desired pharmacological agents.

Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses

Iontophoresis of neural agonists and antagonists during extracellular in vivo recordings is a powerful way to manipulate a neuron&#x2019;s microenvironment. These manipulations can most easily be done via piggy-back multibarrel electrodes. Here we describe how to manufacture them and use them during auditory recordings.

تصنيع واستخدام الخنزير ظهر أقطاب لMultibarrel<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التلاعب الدوائية من الردود العصبية

In vivo recordings from single neurons allow an investigator to examine the firing properties of neurons, for example in response to sensory stimuli. ...

Generation of Local CA1 &#947; Oscillations by Tetanic Stimulation

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A protocol is provided to generate a model for studying CA1 &#947; oscillations (20 - 80 Hz). These &#947; oscillations are stable for at least 30 min&#160;and depend upon excitatory and inhibitory synaptic activity in addition to activation of pacemaker currents. Tetanically stimulated oscillations have a number of reproducible and easily quantifiable characteristics including spike count, oscillation duration, latency and frequency that report upon the network state. The advantages of the electrically stimulated oscillations include stability, reproducibility and episodic acquisition enabling robust characterization of network function. This model of CA1 &#947; oscillations can be used to study cellular mechanisms and to systematically investigate how neuronal network activity is altered in disease and by drugs. Disease state pharmacology can be readily incorporated by the use of brain slices from genetically modified or interventional animal models to enable selection of drugs that specifically target disease mechanisms.

Oscillations are fundamental network properties and are modulated by disease and drugs. Studying brain-slice oscillations allows characterization of isolated networks under controlled conditions. Protocols are provided for the preparation of acute brain slices for evoking CA1 &#947; oscillations.

جيل من التذبذبات CA1 γ المحلية من خلال تحفيز كزازي

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A ...

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

This protocol outlines the procedures for preparing and recording from the isolated whole hippocampus, of WT and transgenic mice, along with recent improvements in methodologies and applications for the study of theta oscillations. A simple characterization of the isolated hippocampal preparation is presented whereby the relationship between internal hippocampal theta oscillators is examined together with the activity of pyramidal cells, and GABAergic interneurons, of the cornu ammonis-1 (CA1) and subiculum (SUB) areas. Overall, we show that the isolated hippocampus is capable of generating intrinsic theta oscillations in vitro and that rhythmicity generated within the hippocampus can be precisely manipulated by optogenetic stimulation of parvalbumin-positive (PV) interneurons. The in vitro isolated hippocampal preparation offers a unique opportunity to use simultaneous field and intracellular patch-clamp recordings from visually-identified neurons to better understand the mechanisms underlying theta rhythm generation.

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

Here, we present a protocol for recording rhythmic neuronal network theta and gamma oscillations from an isolated whole hippocampal preparation. We describe the experimental steps from extraction of the hippocampus to details of field, unitary and whole-cell patch clamp recordings as well as optogenetic pacing of the theta rhythm.

ضبط في الحصين ثيتا الفرقة<em&gt; في المختبر</em&gt;: منهجيات لتسجيل من القوارض معزولة سيبوهيبوكامبال الدائرة

This protocol outlines the procedures for preparing and recording from the isolated whole hippocampus, of WT and transgenic mice, along with recent ...

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the pathophysiological basis of these diseases, it is necessary to precisely characterize in which way the processing of information is disturbed between the different neuronal parts of the circuit. Using extracellular in vivo electrophysiological recordings, it is possible to accurately delineate neuronal activity within a neuronal network. The application of this method has several advantages over alternative techniques, e.g., functional magnetic resonance imaging and calcium imaging, as it allows a unique temporal and spatial resolution and does not rely on genetically engineered organisms. However, the use of extracellular in vivo recordings is limited since it is an invasive technique that cannot be universally applied. In this article, a simple and easy to use method is presented with which it is possible to simultaneously record extracellular potentials such as local field potentials and multiunit activity at multiple sites of a network. It is detailed how a precise targeting of subcortical nuclei can be achieved using a combination of stereotactic surgery and online analysis of multi-unit recordings. Thus, it is demonstrated, how a complete network such as the hyperdirect cortico-basal ganglia loop can be studied in anesthetized animals in vivo.

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

In this study, the methodology is presented on how to perform multi-site in vivo electrophysiological recordings from the hyperdirect pathway under urethane anesthesia.

حاد<em&gt; في فيفو</em&gt; تسجيلات الكهربية للميكانيات الميدانية المحلية والنشاط متعدد الوحدات من مسار هيبيرديركت في الفئران تخدير

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

أوبتوجينيتيك الرائعة للذبذبات ثيتا هيبوكامبال في التصرف الفئران

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed electrical field of a large volume of brain tissue, extracting information about local activity is challenging. Studying neuronal microcircuits, however, requires a reliable distinction between truly local events and volume-conducted signals originating in distant brain areas. Current source density (CSD) analysis offers a solution for this problem by providing information about current sinks and sources in the vicinity of the electrodes. In brain areas with laminar cytoarchitecture such as the hippocampus, one-dimensional CSD can be obtained by estimating the second spatial derivative of the LFP. Here, we describe a method to record multilaminar LFPs using linear silicon probes implanted into the dorsal hippocampus. CSD traces are computed along individual shanks of the probe. This protocol thus describes a procedure to resolve spatially restricted neuronal network oscillations in the hippocampus of freely moving mice.

This protocol describes the recording of local field potentials with multi-shank linear silicon probes. Conversion of the signals using current source density analysis allows the reconstruction of local electrical activity in the mouse hippocampus. With this technique, spatially restricted brain oscillations can be studied in freely moving mice.

تسجيل مكانياً مقيد التذبذبات في قرن آمون التصرف الفئران

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed ...

Electrophysiological Investigations of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapse Function

The lateral geniculate nucleus is the first relay station for the visual information. Relay neurons of this thalamic nucleus integrate input from retinal ganglion cells and project it to the visual cortex. In addition, relay neurons receive top-down excitation from the cortex. The two main excitatory inputs to the relay neurons differ in several aspects. Each relay neuron receives input from only a few retinogeniculate synapses, which are large terminals with many release sites. This is reflected by the comparably strong excitation, the relay neurons receive, from retinal ganglion cells. Corticogeniculate synapses, in contrast, are simpler with few release sites and weaker synaptic strength. The two synapses also differ in their synaptic short-term plasticity. Retinogeniculate synapses have a high release probability and consequently display a short-term depression. In contrast, corticogeniculate synapses have a low release probability. Corticogeniculate fibers traverse the reticular thalamic nuclei before entering the lateral geniculate nucleus. The different locations of the reticular thalamic nucleus (rostrally from the lateral geniculate nucleus) and optic tract (ventro-laterally from the lateral geniculate nucleus) allow stimulating corticogeniculate or retinogeniculate synapses separately with extracellular stimulation electrodes. This makes the lateral geniculate nucleus an ideal brain area where two excitatory synapses with very different properties impinging onto the same cell type, can be studied simultaneously. Here, we describe a method to investigate the recording from relay neurons and to perform detailed analysis of the retinogeniculate and corticogeniculate synapse function in acute brain slices. The article contains a step-by-step protocol for the generation of acute brain slices of the lateral geniculate nucleus and steps for recording activity from relay neurons by stimulating the optic tract and corticogeniculate fibers separately.

Here, we present protocols for the preparation of acute brain slices containing the lateral geniculate nucleus and the electrophysiological investigation of retinogeniculate and corticogeniculate synapses function. This protocol provides an efficient way to study synapses with the high-release and low-release probability in the same acute brain slices.

التحقيقات الكهرولوجية من وظائف المشبك وCorticogeniculate

The lateral geniculate nucleus is the first relay station for the visual information. Relay neurons of this thalamic nucleus integrate input from retinal ...

Recording Gamma Band Oscillations From Pedunculopontine Nucleus Neurons in a Brain Slice

Source: Urbano, F. J., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54685">Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2016).
The video demonstrates the method to record gamma-band oscillations in PPN neurons. Using a sagittal brain section with synaptic blockers in aCSF, it employs positive current pulses via a patch pipette to open calcium channels, inducing crucial subthreshold activity for wakefulness.

تسجيل تذبذبات نطاق جاما من الخلايا العصبية لنواة الساقين في شريحة دماغية

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

تسجيل غاما التذبذبات الفرقة في Pedunculopontine نواة الخلايا العصبية

Summary

Explore More Videos