Name: electrophysiological method for recording intracellular voltage responses of drosophila photoreceptors and interneurons to light stimuli in vivo
Uploaded: 2016-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo at JoVE.com

The authors thank Mick Swann, Chris Askham and Martin Gautrey for their important contributions in designing and building many electrical and mechanical components of the rigs. MJ's current research is supported by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC Grant: BB/M009564/1), the State Key Laboratory of Cognitive Neuroscience and Learning open research fund (China), High-End Foreign Expert Grant (China), Jane and Aatos Erkko Foundation Fellowship (Finland), and the Leverhulme Trust grant (RPG-2012-567).

The authors have nothing to disclose

We have presented the basic key steps of how to use sharp conventional microelectrodes to record intracellular responses of R1-R6 photoreceptors and LMCs in intact fly eyes. This method has been optimized, together with bespoke hardware and software tools, over the last 18 years to provide high-quality long-lasting recordings to answer a wide range of experimental questions. By investing time and resources to construct robust and precise experimental set-ups, and to produce microelectrodes with favorable electrical properties, high-quality recordings can become the norm in any laboratory working on Drosophila visual neurophysiology. Whilst well-designed recording and light stimulation systems are important for swift execution of different experimental paradigms, there are three procedural steps that are even more critical to achieving successful recordings: (i) to make the fly preparation with minimal eye damage, (ii) to pull microelectrodes with the right electrical properties, and (iii) to drive the recording electrode into the eye without breaking its tip. Ultimately, to record meaningful data, the investigator has to understand the physical basis of electrophysiology and how to fabricate suitable microelectrodes for the targeted cell-types.
Therefore, the limitations of this technique are primarily set by the patience, experience and technical ability of the investigator. Because this technique can take a long time to master for small Drosophila cells, it is advisable for trainee electrophysiologists to first practice with larger insect eyes, such as the blowfly36 or locust35, using the same rig. Once performing high-quality intracellular recordings from the larger photoreceptors and interneurons becomes routine, it is time to move on to the Drosophila eye. Another limitation of the technique concerns cellular identification. Penetrated Drosophila cells can be loaded electrophoretically with dyes, including Lucifer yellow or neurobiotin. However, because of the small tip size of the microelectrodes, electrophoresis works less efficiently than with lower resistance electrodes, such as patch-electrodes. Furthermore, the dye-filled microelectrodes characteristically have less favorable electrical properties, making it much harder to record high-quality responses with them from Drosophila photoreceptors and LMCs.
A technical problem that occurs sometimes is unstable input signal, or a complete lack of it. This is often associated with the voltage signal being either constantly drifting or higher/lower than the amplifier's recording range. On most occasions, this behavior is caused by the recording electrode being blocked (or its tip being too fine - having too high a resistance or intramural capacitance - to properly conduct fast signal changes). Although one can try to unblock the tip by buzzing the electrode capacitance, which sometimes works, often the situation is best resolved by simply changing the recording electrode. This may further require parameter adjustments in the microelectrode puller instrument to lower the tip resistance of the new electrodes. The electrode tip can also become blocked in preparations, for which it took too much time to cover the corneal hole by petroleum jelly. Prolonged air-contact can dry up the freshly exposed retinal tissue, turning its surface layer into a glue-like substance. If this is the case, the investigator typically sees a red blob of tissue stuck on the recording electrode when pulling it out of the eye. The only solution here is to make a new preparation. Petroleum jelly may provide many benefits for electrophysiological recordings: (i) it prevents the coagulation of the hemolymph that could break the electrode tip; (ii) it coats the electrode tip reducing its intramural capacitance, which lowers the electrode's time constant, and thus has the potential to improve the temporal resolution of the recorded neural signals40,41; (iii) it keeps the electrode tip clean, facilitating penetrations; and after penetration, (iv) it may even help to seal the electrode tip to the cell membrane42. 
The signal can further be unstable or lost when the silver-chloride wire of the electrode-holder is broken or dechloridized; in which case just replace or rechloridize the old wire. The missing signal can also result from one (or both) of the electrode-holders not being securely connected to their jacks. However, it is extremely unusual that a piece of equipment would be malfunctioning. If signal is undetectable and all other possibilities have been exhausted, test that each part of the recording apparatus, including the headstage, amplifier, low-pass filters and AD/DA-converters, are connected properly and functioning normally. One way to achieve this is to replace each instrument with another from a rig that is known to operate normally. Alternatively, use a signal generator to check the performance of the electronic components one by one.
But perhaps the most common technical problem facing the electrophysiologist is that of recording noise. Broadly, recording noise is the observed electrical activity other than the direct neuronal response to a given stimulus. Because the fly preparation, when properly done, is very stable, the observed noise (beyond the natural variably of the responses) most often results from ground-loops in the recording equipment, or is picked up from nearby electrical devices. Such noise is typically 50/60 Hz mains hum and its harmonics; but sometimes composed of more complex waveforms. To work out the origin of the noise, remove the fly preparation holder from the set-up, connect the recording and reference electrodes through a drop of fly Ringer (or place them in a small Ringer's solution bath; see step 1.2.6) and record the signal in CC- or bridge-mode. If noise is observable on the recorded signal, this likely means that the noise is external to the fly preparation.
Another good test for identifying the origin of noise is to replace the electrode-holders with an electric cell model connected to the amplifier. In an ideally configured and grounded set-up, the recorded signal should now be practically noise-free, showing only stochastic bit-noise from the AD-converter (in the best case not even that!). If noise is still present, then recheck that all rig equipment is properly grounded. A convenient approach to detect ground-loops is to: (i) disconnect all the grounding wires from all the parts within the rig; (ii) ensure that, after doing this, every single part is actually isolated from ground, by means of an ohm-meter; (iii) connect the parts, one by one, to the central ground directly, not through any other part of the rig. Try also changing the equipment configurations. For example, sometimes moving the computer and monitor further away from the rig can reduce noise; yet at other times, moving the computer inside the equipment rack reduces noise. It is also worth unplugging nearby equipment to see if noise is reduced, or shield additional components. Furthermore, try unplugging or replacing different components of the recording equipment, especially BNC cables (which can have faulty ground connections). If only bit-noise is observed when using the cell model, the initial noise source is either the electrodes or the fly preparation itself. For example, it could be that the reference electrode is inadvertently touching a motor nerve or active muscle fibers inside the head capsule (or disturbing flight muscles in the thorax - if placed there). It is usually simplest to prepare a new fly for recording, taking care to minimize damage to the fly. But if the noise persists and is broadband, it is likely that the electrodes are suboptimal for the experiments; too sharp/fine (hence too noisy) or just wrong for the purpose; we have even seen quartz-electrodes acting as antennas - picking up faint broadcasting signals! Although iteration of the puller-instrument parameter settings to generate the just right microelectrodes for consistent high-quality recordings from specific cell-types can take a lot of effort, it is worth it. Once the recording electrodes are well-tailored for the experiments, they can provide long-lasting recordings of outstanding quality.
Sharp microelectrode recording techniques can be similarly applied to study neural information processing in multitude of preparations, including different processing layers in the insect eyes and brain43,44. Because the microelectrode tips can be made very fine, these typically damage the studied cells less than most patch-clamp applications. Importantly, the modern sample-and-hold microelectrode amplifiers enable good control of the tips' electrical properties40,45-47. Thus, when correctly applied, this technique can provide reliable data from both in vivo3,5,7-10,44 or in vitro48 preparations with high signal-to-noise ratio at sub-millisecond resolution. Such precision would be impossible with today's optical imaging techniques, which are noisier and slower. Moreover, the method can be used to characterize small cells' electrical membrane properties both in current- and voltage-clamp configurations5,29,33,36,40-42,49, providing valuable data for biophysical and empirical modeling approaches7,8,11,33,49-54 that link experiments to theory.

ذبابة الفاكهة (ذبابة الفاكهة) مجمع العين هو نظام نموذج رائع للتحقيق في التنظيم الوظيفي للمبصرة وعصبون المصفوفات لأخذ العينات صورة العصبية وتجهيزها، ولرؤية الحيوانات. النظام لديه مخطط الأسلاك الأكثر اكتمالا 1،2 وودي إلى التلاعب الجيني ودقيقة للرصد النشاط العصبي (ارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء والوقت قرار) 3-10. العين ذبابة الفاكهة هي وحدات، والتي تحتوي على 750 ~ الهياكل المغطاة عدسة على ما يبدو العادية يسمى ommatidia، والتي توفر معا تطير المجال البصري بانورامية التي تغطي الاتجاه تقريبا في جميع أنحاء رأسه. المعلومات الأولية العين أخذ العينات وحدات هي خلايا مستقبلة للضوء رابدوميريك لها 7،8،11. كل مقيلة يحتوي على ثمانية خلايا مستقبلة للضوء (R1-R8)، التي تشترك في نفس العدسة الوجه ولكن الانحياز إلى سبعة اتجاهات مختلفة. في حين أن خلايا مستقبلة للضوء الخارجي R1-R6 عالبريد الأكثر حساسية للضوء الأخضر والأزرق والحساسيات الطيفية للخلايا الداخلية R7 وR8، التي تقع فوق بعضها البعض، وأشر إلى نفس الاتجاه، المعرض ثلاثة أنواع فرعية مميزة: شاحب والأصفر وظهري منطقة حافة (DRA) 12- 15. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig1.jpg" /> الشكل 1. منظمة الوظيفية من ذبابة الفاكهة العين. (أ) أول اثنين من العقد البصري، شبكية العين والصفيحة، ويسلط الضوء في الرمادي داخل العين الطاير. مبصرات شبكية العين R1-R6 والصفيحة خلايا القطب كبيرة (LMCs: L1-L3) يمكن الوصول إليها بسهولة في الجسم الحي إلى تسجيلات مسرى مكروي حادة التقليدية. القطب التخطيطي يسلط الضوء على مسار طبيعي للتسجيل من R1-R6 في شبكية العين. مسار واحد لتسجيل من LMCs في الصفيحة هو التحول في مواز القطب إلى اليسار. (ب) صفيحة هو مصفوفة من الجهاز retinotopicallyخراطيش أوتوماتيكية، كل واحدة منها هي معبأة مع الخلايا العصبية التي بمعالجة المعلومات من منطقة صغيرة محددة في الفضاء البصري. بسبب تراكب العصبي، ست خلايا مستقبلة للضوء من ommatidia المجاورة مختلفة ترسل محاور منها (R1-R6) لنفس خرطوشة الصفيحة، وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي الناتج هيستاميني الفعل إلى L1-L3 وخلية عديم الاستطالات (ص). (ج) نشر المعلومات العصبية بين محطات محوار R1-R6 وinterneurons البصرية (بما في ذلك L4، L5، Lawf، C2، C3 و T1)، داخل خرطوشة الصفيحة معقدة. (D) R1-R6 محاور مبصرة تتلقى ردود متشابك من L2 و L4 خلايا أحادي. (ب) و (ج) المعدلة من ريفيرا ألبا وآخرون (2). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54142/54142fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> العين ذبابة الفاكهة هي من نوع العصبية تراكب 16. وهذا يعني رقبعة الإشارات العصبية من المستقبلات الضوئية ثمانية ينتمون إلى سبع ommatidia المجاورة، والتي تبدو في نفس النقطة في الفضاء، يتم تجميع معا في خرطوشة العصبية واحدة في neuropils المقبلين: الصفيحة والنخاع. في حين أن ستة خلايا مستقبلة للضوء الخارجي R1-R6 مشروع محطات محوار لأعمدة العصبية في الصفيحة (الشكل 1)، وخلايا R7 وR8 تجاوز هذه الطبقة وإجراء اتصالات متشابك مع هم العمود النخاع 17-19 المقابلة. هذه التمديدات الدقيق تنتج الركيزة العصبية لرسم خرائط شبكي التوضع من رؤية الطيران في وقت مبكر، وعندها كل الصفيحة (الشكلان 1A-C) والعمود النخاع (خرطوشة) يمثل نقطة واحدة في الفضاء. وردت مدخلات مباشرة من المستقبلات الضوئية R1-R6 من قبل خلايا القطب كبيرة (LMCs: L1 و L2 و L3) وخلية عديم الاستطالات (ص) في الصفيحة 1،2،20. للخروج من هذه، L1 و L2 هي أكبر الخلايا، والتوسط مسارات المعلومات الكبرى (1D الشكل)، مبادرة الخوذ البيضاء<html> الفصل الاستجابة إلى داخل وخارج حواف تتحرك، وبالتالي تشكل الأساس الحسابي لكشف الحركة 21،22. التجارب السلوكية تشير إلى أن في المقابل المتوسط، ومسارات اثنين تسهل تصور الحركة من اتجاهين متعاكسين:-العودة إلى الجبهة في L1 ومن الأمام إلى الخلف في الخلايا L2 23،24. يعني الربط أيضا أن الخلايا العصبية L4 قد تلعب دورا حاسما في التواصل الأفقي بين خراطيش المجاورة 25،26. تم العثور على نقاط الاشتباك العصبي متبادلة بين الخلايا L2 و L4 تقع في نفس واثنين من خراطيش المجاورة. المصب، كل خلية L2 وثلاث خلايا L4 المرتبطة مشروعها المحاور الخاصة بهم إلى الهدف المشترك، والخلايا العصبية TM2 في النخاع، حيث يعتقد المدخلات من خراطيش المجاورة لتكون متكاملة لتجهيز الأمام إلى الخلف حركة 27. على الرغم من أن الخلايا العصبية L1 تلقي المدخلات من نفس خرطوشة L2s سواء عن طريق تقاطعات الفجوة ونقاط الاشتباك العصبي، فهي ليست مرتبطة مباشرة إلى خراطيش الصفيحة L4s وبالتالي المجاورة. الطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; يتم توفير تغذية مرتدة متشابك إلى محاور مبصرة R1-R6 فقط من الخلايا العصبية التي تنتمي إلى دوائر / L4 L2 لكن ليس L1 مسار 1،2 (1D الشكل). بينما صلات نفس خرطوشة هي انتقائي من L2 لR1 و R2 ومن L4 لR5، تتلقى جميع المستقبلات الضوئية R1-R6 ردود الفعل متشابك من L4 من أحدهما أو كليهما خراطيش المجاورة. وعلاوة على ذلك، هناك اتصالات متشابك قوية من صباحا إلى R1، R2، R4 وR5، والخلايا الدبقية أيضا على اتصال synaptically إلى الشبكة، وبالتالي يمكن أن تشارك في معالجة الصور العصبي 6. وأخيرا، محور عصبي الفجوة تقاطعات، وربط R1-R6 وبين R6 وR7 / R8 المستقبلات الضوئية المجاورة في الصفيحة، والمساهمة في تمثيل المعلومات غير المتماثلة والمعالجة في كل خرطوشة 14،20،28. تسجيلات الجهد داخل الخلايا من خلايا مستقبلة للضوء الفردية وinterneurons البصرية في ذبابة الفاكهة سليمة تقريبا توفر عالية ص الإشارة إلى الضوضاءالبيانات ATIO في قرار ميلي ثانية واحدة الفرعي 3،5،7-10،29، وهو أمر ضروري لجعل الشعور الحسابية العصبية السريعة بين الخلايا العصبية المتصلة. هذا المستوى من الدقة أمر مستحيل من خلال تقنيات التصوير الضوئية الحالية، والتي هي ضجيج كبير وتعمل عادة في 10-100 قرار مللي ثانية. وعلاوة على ذلك، لأن أقطاب لديها نصائح صغيرة جدا وحادة، لا يقتصر على طريقة لأجسام الخلايا، ولكن يمكن أن توفر التسجيلات المباشرة من الهياكل العصبية نشطة الصغيرة؛ مثل أشجار شجيري من LMCs &quot;أو المحاور العصبية مستقبلة للضوء، والتي لا يمكن الوصول إليها من قبل نصائح أكبر بكثير من الأقطاب الكهربائية التصحيح، المشبك. الأهم من ذلك، فإن هذه الطريقة أيضا هيكليا أقل الغازية وضررا من معظم التطبيقات التصحيح، المشبك، وذلك يؤثر على أقل الوسط والمعلومات أخذ العينات داخل الخلايا الخلايا درس. وهكذا، وقد ساهمت التقنيات مسرى مكروي حادة التقليدية، والحفاظ على المساهمة والاكتشافات الأساسية والبصيرة الأصلي إلى تقنية المعلومات العصبيةمعالجة املعلومات في نطاق الوقت المناسب. تحسين فهمنا الآلية الرؤية 3-10. توضح هذه المقالة كيفية في التسجيلات داخل الخلايا المجراة من ذبابة الفاكهة خلايا مستقبلة للضوء R1-R6 وLMCs تتم في المختبر Juusola. وهذا البروتوكول يصف كيفية بناء تلاعب الكهربية مناسبة، وإعداد الطاير، وإجراء التسجيلات. ويرد بعض البيانات تمثيلا، وتتم مناقشة بعض القضايا المشتركة والحلول المحتملة التي قد تواجهها عند استخدام هذا الأسلوب.

<table><tbody><tr><td>Stereo Zoom Microscope for making the fly preparation</td><td>Olympus</td><td>SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN30x-H/22</td><td>Capable of ~150X magnification with long working distance; bespoke heavy steel table mount stand</td></tr><tr><td>Stereomicroscope in the intracellular set-up</td><td>&amp;middot;&amp;nbsp; Olympus</td><td>Olympus SZX7; eyepieces: WHN30x-H/22</td><td>30X eyepieces are needed for seeing the electrode tip reflections well when driving it through the small corneal hole into the eye</td></tr><tr><td>Nikon microscope</td><td>Nikon SMZ645; eyepieces: C-W30x/7</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-vibration Table</td><td>Melles Griot</td><td>With metric M6 holes on the breadboard</td><td>Our bespoke rigs have a large hole drilled through the thick breadboard that lets in the fly preparation platform pole (houses a copper heatsink with electronics) from below</td></tr><tr><td>Newport</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulators</td><td>Narishige</td><td>Narishige NMN-21</td><td>In our intracellular set-ups, different micromanipulator systems are used for driving the shap recording electrodes into the fly eye. All the listed manipulators are succesfully providing long-lasting stable recordings from Drosophila photoreceptors and LMCs.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Huxley Bertram</td><td>Huxley xyz-axis with fine manual control</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sensapex</td><td>Sensapex triple axis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M&amp;auml;rzh&amp;auml;user</td><td>M&amp;auml;rzh&amp;auml;user DC-3K with additional x-axis piezo stepper and MS 314 controller</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stands</td><td>Any magnetic base with on/off switch will do</td><td></td><td>For example, to manage cables inside the Faraday cage</td></tr><tr><td>Electrode Holders</td><td>Harvard Apparatus</td><td>ESP/W-F10N</td><td></td></tr><tr><td>Silver Wire</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>AGW1510</td><td>0.3 - 0.5 mm diameter; needs to be chloridized for the electrode holders</td></tr><tr><td>Fiber Optic Light Source</td><td>Many different, including Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiber Optic Bundles</td><td>UltraFine Technology</td><td></td><td>To deliver the LED light stimulus to the Cardan arm system. We use both liquid and quartz light guides (range from UV to IR)</td></tr><tr><td>Thorn Labs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly Cathing Tube</td><td></td><td>P80-50P 50ml Cent. Tube PP., Pack of 100 Pcs</td><td>Cut the conical bottom off from 50 ml Plastic Centrifuge Tube and glue a 1 ml pipette tip on it.</td></tr><tr><td>Digital Acquisition System</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single-electrode current/voltage-clamp microelectrode amplifier</td><td>npi SEC-10LX</td><td>http://www.npielectronic.de/products/amplifiers/sec-single-electrode-clamp/sec-10lx.html</td><td>Outstanding performer!</td></tr><tr><td>Head-stage</td><td>Standard (+/- 150 nA)</td><td>For npi SEC-10LX</td><td></td></tr><tr><td>LED light sources and drivers</td><td>2-channel OptoLED (Cairn Research Ltd., UK)</td><td></td><td>Many of our stimulus systems are in-house built&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Self-designed and constructed</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acquisition and Analyses Software</td><td>Many companies to choose from</td><td></td><td>Biosyst; custom written Matlab-based system for experimental and theoretical work in the Juusola laboratory</td></tr><tr><td>Personal Computer or Mac</td><td></td><td></td><td>Ensure that PC or Mac is compatible with data acquisition system and software</td></tr><tr><td>Cardan arm system&amp;nbsp;</td><td>Self-designed and constructed</td><td></td><td>Providing accurate x,y,z-positioning of the light stimuli</td></tr><tr><td>Peltier temperature control system&amp;nbsp;</td><td>Self-designed and constructed</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Faraday Cage</td><td>Self-constructed</td><td></td><td>Electromagnetic noise shielding</td></tr><tr><td>Filamented Borosilicate Glass Capillaries</td><td></td><td>Outer diameter: 1 mm</td><td></td></tr><tr><td>Inner diameter: 0.5 - 0.7 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filamented Quartz Glass Capillaries</td><td></td><td>Outer diameter: 1 mm</td><td></td></tr><tr><td>Inner diameter: 0.5 - 0.7 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette Puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Model P-2000 laser Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>For borosilicate reference electrodes, use the preset program #11 (patch electrodes): Heat = 350; Filament = 4; Velocity 36; Delay = 200).1.2.1). For borosilicate recording electrodes, use the preset program #12 (this typically pulls good conventional sharps&amp;nbsp; for photoreceptor recordings): Heat = 355; Filament = 4; Velocity 50; Delay = 225; Pull = 150. For LMC recordings, which require electrodes with finer tips, these values need to be adjusted. For pulling quartz capillaries, P-2000 manual suggests programs for fine tipped microelectrodes. These programs&amp;rsquo; preset parameters serve as useful starting points for systematic modifications to generate electrodes with good penetration success and low recording noise.</td></tr><tr><td>Extracellular Ringer Solution for the reference electrode</td><td>Chemicals from Fisher Scientific</td><td>10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, sucrose</td><td>See the recipe in the protocol section</td></tr><tr><td>3 M KCl solution for filling the filamented recording microelectrode</td><td>Salts from Fisher Scientific</td><td>10010310, KCl</td><td></td></tr><tr><td>Petroleum jelly</td><td>Vaselin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Non-stainless steel razor blades</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blade holder/breaker</td><td>Fine Science Tools By Dumont</td><td>10053-09</td><td>9 cm</td></tr><tr><td>Blu-tack</td><td>Bostik</td><td></td><td>Alternatively, use molding clay</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools By Dumont</td><td>11252-00</td><td>#5SF (super-fine tips)</td></tr></tbody></table>

electrophysiological method for recording intracellular voltage responses of drosophila photoreceptors and interneurons to light stimuli in vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

طريقة الحاد تسجيل مسرى مكروي، وتكييفها هنا للعين ذبابة الفاكهة، ويمكن استخدامها لقياس موثوق أخذ العينات العصبية المعلومات ومعالجتها في خلايا شبكية العين والصفيحة، والاتصالات بينهما 4،5،7،8،10،33. عن طريق استخدامه لدراسة الترميز في مختلف الأسهم من النوع البري، المسوخ أو سلالات ذبابة المعدلة وراثيا، وقد ثبت أن الطريقة قيمتها. ليس فقط في قياس آثار الطفرة، ودرجة الحرارة، والنظام الغذائي، أو في المختارة التعبير 3،4،6،9،10،14،30،34، ولكن أيضا في الكشف عن الأسباب الميكانيكية لسلوكيات البصرية المتغيرة 14،34. طريقة ينطبق أيضا بسهولة إلى الاستعدادات الحشرات الأخرى 35،36، وتمكين دراسات رؤية neuroethological. بعد ذلك قمنا بعرض بعض الأمثلة على تطبيقاته الناجحة. <img alt="الرقم 7" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig7.jpg" /> الرقم 7. الجهد<html> ردود على ذبابة ثمار R1-R6 مبصرة لنبض الضوء في 20 و 25 درجة مئوية بسبب الاختراقات مسرى مكروي حادة غالبا ما تكون مستقرة جدا، فمن الممكن لتسجيل استجابات الجهد من نفس مبصرة R1-R6 لحافز خفيفة معينة في درجات الحرارة المحيطة مختلفة عن الاحترار أو التبريد الطاير. في لدينا مجموعة عمليات، يتم وضع الطيران حامل على نظام التحكم في درجة الحرارة حلقة قريبة أساس بلتيير عنصر. وهذا يمكننا من تغيير الذبابة درجة حرارة الرأس في ثوان. ارتفاع درجة الحرارة يسرع الردود الجهد ومميز يقلل من إمكانات يستريح من المستقبلات الضوئية R1-R6 (كما يتبين من السهام الحمراء). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54142/54142fig7large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> دراسة تأثير درجة الحرارة على الناتج مبصرة الآثار البيئية-together.within الصفحات = &quot;1&quot;&gt; مع مصممة تصميما جيدا ونظام تسجيل معزولة الاهتزاز، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم لقياس تأثير درجة الحرارة على الانتاج العصبية خلية فردية من قبل ارتفاع درجات الحرارة أو التبريد الطاير. يوضح المثال المعطى الردود الجهد لنبضة 10 ميللي ثانية طويل مشرق، وسجلت في نفس مبصرة R1-R6 في 20 و 25 درجة مئوية (الشكل 7). كما كميا قبل 4،9، والاحترار يخفض احتمال يستريح على مستقبلة للضوء في الظلام، وتسارع ردود الجهد لها. <img alt="شكل 8" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig8.jpg" /> الرقم 8. اشارة الأداء على ذبابة ثمار R1-R6 مبصرة يحسن مع شدة الضوء (A) الناتج مبصرة لقاتمة (أدناه) ومشرقة. (أعلاه؛ 10،000 مرات أكثر إشراقا ضوء) تتكرر الطبيعية شدة الضوء السلاسل الزمنية التي سجلتها نفسه مسرى مكرويفي نفس الخلية في 20 درجة مئوية. الردود على التحفيز مشرق أكبر، لأنها تدمج المزيد من العينات، ردود الابتدائية (المطبات) إلى الفوتونات واحدة 4،5،7،8. (ب) يتم فرضه 20 الردود الجهد متتالية ثانية واحدة طويلة. اتخذت الاستجابات الفردية (رمادي فاتح) بعد الاتجاهات التكيفية (السهم في A) قد انحسر (مربع منقط في A). وسائل الاستجابة المقابلة (الإشارات) هي آثار قتامة. الفرق بين إشارة والاستجابات الفردية هو الضجيج. &quot;وكان كميا أداء الإشارات التي كتبها التسجيلات&quot; (C) الخلايا نسب الإشارة إلى الضوضاء (SNR) باستخدام الطرق القياسية 4،5،7،8. الناتج مبصرة لديها مجموعة وحوالي 64 هرتز أوسع من الإشارات الموثوق بها على التحفيز مشرق (SNR &quot;≥1 مشرق، تصل إلى 84 هرتز) عما كانت عليه في قاتمة (SNR&quot; خافت ≥1، تصل إلى 20 هرتز)، مع الصورةignal إلى نسبة الضوضاء تتحسن إلى حد كبير؛ من SNR خافت MAX = 87 إلى SNR برايت MAX = 1،868. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54142/54142fig8large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> دراسة التكيف والعصبية ترميز بواسطة المتكرر تحفيز وnoninvasiveness الأسلوب، مما تسبب في أضرار طفيفة نسبيا في هياكل شبكية العين والصفيحة، يجعلها مثالية لدراسة أداء الإشارات من الخلايا الفردية للمؤثرات ضوئية مختلفة في القريب الحالة الفسيولوجية الطبيعية في الجسم الحي. الشكل 8 يظهر استجابات الجهد من R1- R6 مبصرة لضوء الوقت كثافة طبيعي سلسلة من الحوافز قاتمة ومشرق المتكررة عند 20 درجة مئوية، في حين أن الرقم 9 </stronز&gt; يظهر ردود مبصرة R1-R6 آخر ومركز إدارة السيولة المالية لحافز طبيعي مختلفة في 25 درجة مئوية. أجريت التسجيلات قبل وبعد المشبكي بشكل منفصل عن اثنين من الذباب مختلفة لأن التسجيلات داخل الخلايا في وقت واحد من قبل اثنين من الميكروية حادة في نفس الطيران، واحدة في شبكية العين، والآخر في الصفيحة، من الصعب جدا أن تكون قابلة للحياة 30. <img alt="الرقم 9" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig9.jpg" /> الرقم 9. الردود الجهد من ذبابة الفاكهة R1-R6 مبصرة ومركز إدارة السيولة المالية إلى تكرار طبيعي تحفيز على 25 درجة مئوية (A) R1-R6 (الرمادي) ومركز إدارة السيولة المالية (أسود) النواتج التي سجلتها الميكروية مختلفة من الذباب مختلفة. (ب) 20 ما قبل ضوء تكييفها بالكامل على التوالي (أعلاه) وبعد المشبكي (أدناه) الردود على نفس النمط التحفيز الطبيعي مع الاستجابات الفردية، كما هو موضح في ضوء رمادي لد وسائل المقابلة استجابة (الإشارات) على أنها آثار قتامة. الفرق بين إشارة والاستجابات الفردية هو الضجيج. &quot;وكان كميا أداء الإشارات التي كتبها التسجيلات&quot; (C) الخلايا نسب الإشارة إلى الضوضاء (SNR). مركز إدارة السيولة المالية الانتاج لديها مجموعة وحوالي 10 هرتز أوسع من إشارات يمكن الاعتماد عليها (SNR &quot;مركز إدارة السيولة المالية ≥1، تصل إلى 104 هرتز) من الناتج R1-R6 (SNR &#39;R ≥1، وتصل إلى 94 هرتز). كل من نسب الإشارة إلى الضوضاء مرتفعة (SNR مركز إدارة السيولة المالية MAX = 142، SNR R MAX = 752)، وكما كان الضجيج تسجيل منخفضة، وخلافاتهم تعكس الاختلافات الترميز حقيقية بين الخلايا. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54142/54142fig9large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> بعد ظهور التحفيز، والتسجيلات نموذجيةلاي تظهر التكيف بسرعة الاتجاهات التي تهدأ إلى حد كبير داخل 5-6 ثانية. ومنذ ذلك الحين، والخلايا تنتج استجابات متسقة للغاية على كل 1 ثانية عرض الحوافز طويلة (كل مربع منقط يرفق 20 من هذه). والتكرار من الردود يصبح واضحا عندما يتم فرضه هذه (الشكل 8B والشكل 9B). الاستجابات الفردية هي آثار رمادية رقيقة، ويعني بها سمكا أكثر قتامة أثر. يتم أخذ استجابة يعني مثل إشارة العصبية، في حين أن الضجيج العصبي هو الفرق بين المتوسط ​​وكل 4،5،9،37،38 استجابة الفرد. وقد تم الحصول على نسب كل إشارة إلى الضوضاء في نطاق التردد (الشكل 8C والشكل 9C) من خلال فورييه تحويل الإشارة والضجيج قطع البيانات إلى أطياف السلطة، وتقسيم متوسط ​​طيف الطاقة إشارة مع ما يوازيها من متوسط ​​الضوضاء السلطة الطيف 4، 5،9،37،38. مميز، الحد الأقصى للنسب الإشارة إلى الضوضاء سو مخرجات العصبية المسجلة لتحفيز طبيعي مرتفعة (100 - 1000)، وفي الأعمال التحضيرية الأكثر استقرارا مع منخفضة جدا الضوضاء التسجيل يمكن أن تصل إلى القيم &gt;&gt; 1000 (على سبيل المثال، الشكل 8C). لاحظ أيضا أن الاحترار توسع الخلايا عرض النطاق الترددي من موثوق يشير 4 (SNR &quot;برايت ≥ 1)؛ على سبيل المثال، والفرق النسبي بين اثنين R1-R6S في أرقام 8 و 9 على التوالي، هو 10 هرتز (84 في 20 درجة مئوية و 94 هرتز عند 25 درجة مئوية). يمكن للمرء أن أبعد تقدير نسبة كل خلية من نقل المعلومات من لنسبة الإشارة إلى الضوضاء باستخدام معادلة شانون 32، أو عن طريق حساب الفرق بين معدلات الكون الكون والضوضاء الردود من خلال طريقة الاستقراء الثلاثي 39. مزيد من التفاصيل عن التحليلات النظرية المعلومات واستخدامها والحدق على وجه التحديد مع هذه الطريقة هي التي وردت في المنشورات السابقة 7،8،39. <img alt="الرقم 10" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig10.jpg" /> الرقم 10. الردود الجهد من القاتل ذبابة R1-R6 مبصرة ومركز إدارة السيولة المالية إلى تكرار طبيعي تحفيز على 19 درجة مئوية (A) R1-R6 (الرمادي) ومركز إدارة السيولة المالية (أسود) النواتج التي سجلتها نفسه مسرى مكروي من نفس ذبابة. postsynaptically أولا وبعد ذلك presynaptically، كما تقدمت القطب في العين. تم القبض على (ب) 20 ما قبل التوالي (أعلاه) وبعد المشبكي (أدناه) الردود (آثار رمادي فاتح) على نفس نمط التحفيز الطبيعي بعد التكيف الأولي (مربع منقط في A). وسائلهم هي إشارات (آثار قتامة على أعلى)، في حين أن الاختلافات كل منهما إلى الاستجابات الفردية تعطي الضوضاء. (ج) سينيا المقابلةتم حساب نسب لتر إلى الضوضاء (SNR) كما هو الحال في أرقام 8C و9C. مركز إدارة السيولة المالية الانتاج لديها نحو مجموعة 100 هرتز أوسع من إشارات يمكن الاعتماد عليها (SNR &quot;مركز إدارة السيولة المالية MAX ≥1، وتصل إلى 234 هرتز) من الناتج R1-R6 (SNR &#39;R MAX ≥1، تصل إلى 134 هرتز). كل من نسب الإشارة إلى الضوضاء مرتفعة (SNR مركز إدارة السيولة المالية MAX = 137، SNR R MAX = 627)، وكما تم استخدام نفس مسرى مكروي في التسجيلات، خلافاتهم تعكس اختلافات حقيقية في مخرجات العصبية قبل وبعد المشبكي. وتعني هذه النتائج أن نظام تسجيل زيارتها انخفاض مستوى الضجيج، وكان تأثيره على التحليلات هامشية. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54142/54142fig10large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> Neuroethological الدراسات الرؤية </p&gt; يمكن أن تستخدم أيضا طريقة لتسجيل استجابات قبل وبعد المشبكي الجهد من عيون مجمع أنواع الحشرات المختلفة 7،8،35،36 (الشكل 10)، والسماح الدراسات neuroethological النسبية لمعالجة المعلومات البصرية. لنظام تسجيل المقدمة، والتكيف المطلوب فقط هو أصحاب إعداد جديد، مع كل فتحة مناسبة الحجم لتلك الانواع. هذه التسجيلات المثالية هي من قاتل الإناث ذبابة (Coenosia attenuata). وهي تظهر استجابات الجهد داخل الخلايا لمبصرة R1-R6 ومركز إدارة السيولة المالية لمطابقة التحفيز ضوء المتكررة، كما تستخدم لنظرائهم ذبابة الفاكهة في الشكل 9، ولكن في 19 درجة مئوية. في هذه الحالة، وسجلت كل من قبل والبيانات بعد المشبكي من نفس ذبابة. واحدا تلو الآخر، مع نفس تسجيل الكهربائي (مليئة 3 M بوكل) تقدم لأول مرة من خلال الصفيحة الجانبية قبل الدخولجي الشبكية الأمامية. وبالمقارنة مع بيانات ذبابة الفاكهة في 25 درجة مئوية، والبيانات Coenosia - حتى في درجة حرارة أكثر برودة - يظهر استجابات مع ديناميات أسرع. توسيع نطاق إشارات موثوقة (نسبة الإشارة إلى الضوضاء &gt;&gt; 1) على نطاق وتردد على نطاق أوسع. هذه التكيفات الوظيفية في ترميز العصبي للمحفزات طبيعية تتماشى مع نمط الحياة Coenosia الصورة المفترسة 36، والتي تتطلب درجة عالية من الدقة المعلومات الزمانية المكانية لتحقيق سريع السلوكيات الصيد الجوي.

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo at JoVE.com

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

الطريقة الكهربية لالردود تسجيل بين الخلايا الجهد ل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; خلايا مستقبلة للضوء وInterneurons إلى النور المحفزات<em&gt; في فيفو</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

electrophysiological-method-for-recording-intracellular-voltage

Universidad San Sebastian

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Electrical Engineering

Neuroscience

Unit 1

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

System Protection

SCIENTISTS IN ACTION

18.7K Views.  Beijing Normal University. Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Video: Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. The larval neuromuscular system is a model synapse for the study of synaptic physiology and neurotransmission, and is a valuable research tool that has defined genetics and is accessible to experimental manipulation. Larvae can be dissected to expose the body wall musculature, central nervous system, and peripheral nerves. The muscles of Drosophila and their innervation pattern are well characterized and muscles are easy to access for intracellular recording. Individual muscles can be identified by their location and orientation within the 8 abdominal segments, each with 30 muscles arranged in a pattern that is repeated in segments A2 - A7. Dissected drosophila larvae are thin and individual muscles and bundles of motor neuron axons can be visualized by transillumination1. Transgenic constructs can be used to label target cells for visual identification or for manipulating gene products in specific tissues. In larvae, excitatory junction potentials (EJP&#8217;s) are generated in response to vesicular release of glutamate from the motoneurons at the synapse. In dissected larvae, the EJP can be recorded in the muscle with an intracellular electrode. Action potentials can be artificially evoked in motor neurons that have been cut posterior to the ventral ganglion, drawn into a glass pipette by gentle suction and stimulated with an electrode. These motor neurons have distinct firing thresholds when stimulated, and when they fire simultaneously, they generate a response in the muscle. Signals transmitted across the NMJ synapse can be recorded in the muscles that the motor neurons innervate. The EJP&#8217;s and minature excitatory junction potentials (mEJP&#8217;s) are seen as changes in membrane potential. Electrophysiological responses are recorded at room temperature in modified minimal hemolymph-like solution2 (HL3) that contains 5 mM Mg2+ and 1.5 mM Ca2+. Changes in the amplitude of evoked EJP&#8217;s can indicate differences in synaptic function and structure. Digitized recordings are analyzed for EJP amplitude, mEJP frequency and amplitude, and quantal content.

Here we describe electrophysiological methods for measuring synaptic transmission at the neuromuscular junction of Drosophila larva. Evoked release is initiated artificially by stimulating the motor neuron axons, and transmission through the NMJ can be measured by the postsynaptic response evoked in the muscle.

الكهربية طرق تسجيل الإمكانيات متشابك من يرقات ذبابة الفاكهة من NMJ

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

Biology

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

الكهربية في تسجيل ذبابة الفاكهة الأجنة

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the researcher to measure gustatory responses directly and quantitatively, reflecting the sensory input that the insect nervous system receives from taste stimuli in its environment. This protocol outlines all key steps in performing this technique. The critical steps in assembling an electrophysiology rig, such as selection of necessary equipment and a suitable environment for recording, are delineated. We also describe how to prepare for recording by making appropriate reference and recording electrodes, and tastant solutions. We describe in detail the method used for preparing the insect by insertion of a glass reference electrode into the fly in order to immobilize the proboscis. We show traces of the electrical impulses fired by taste neurons in response to a sugar and a bitter compound. Aspects of the protocol are technically challenging and we include an extensive description of some common technical challenges that may be encountered, such as lack of signal or excessive noise in the system, and potential solutions. The technique has limitations, such as the inability to deliver temporally complex stimuli, observe background firing immediately prior to stimulus delivery, or use water-insoluble taste compounds conveniently. Despite these limitations, this technique (including minor variations referenced in the protocol) is a standard, broadly accepted procedure for recording Drosophila neuronal responses to taste compounds.

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

This protocol describes extracellular recording of the action potential responses fired by labellar taste neurons in Drosophila.

تسجيل الكهربية من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; Labellar طعم الشعيرات

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila express gustatory receptors1,2, ion channels3-6, and ionotropic receptors7 that are involved in the detection of volatile and non-volatile sensory cues. These neurons directly contact tastants such as food, noxious substances and pheromones and therefore influence many complex behaviors such as feeding, egg-laying and mating. Electrode recordings and calcium imaging have been widely used in insects to quantify the neuronal responses evoked by these tastants. However, electrophysiology requires specialized equipment and obtaining measurements from a single taste sensillum can be technically challenging depending on the cell-type, size, and position. In addition, single neuron resolution in Drosophila can be difficult to achieve since taste sensilla house more than one type of chemosensory neuron. The live calcium imaging method described here allows responses of single gustatory neurons in live flies to be measured. This method is especially suitable for imaging neuronal responses to lipid pheromones and other ligand types that have low solubility in water-based solvents.

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

قياس الاستجابات الفسيولوجية لل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الخلايا العصبية الحسية إلى الدهن الفيرومونات عن طريق لايف التصوير الكالسيوم

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Immunology and Infection

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular recording has historically been a common technique used to study sensitivities of individual photoreceptor cells to different light stimuli that is still being used today. However, there remains a dearth of detailed methodology in the literature for researchers wishing to replicate intracellular recording experiments in the eye. Here we present the insect as a model for examining eye physiology more generally. Insect photoreceptor cells are located near the surface of the eye and are therefore easy to reach, and many of the mechanisms involved in vision are conserved across animal phyla. We describe the basic procedure for in vivo intracellular recording of photoreceptor cells in the eye of a butterfly, with the goal of making this technique more accessible to researchers with little prior experience in electrophysiology. We introduce the basic equipment needed, how to prepare a live butterfly for recording, how to insert a glass microelectrode into a single cell, and finally the recording procedure itself. We also explain the basic analysis of raw response data for determining spectral sensitivity of individual cell types. Although our protocol focuses on determining spectral sensitivity, other stimuli (e.g., polarized light) and variations of the method are applicable to this setup.

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

The electrophysiological technique of intracellular recording is demonstrated and used to determine spectral sensitivities of single photoreceptor cells in the compound eye of a butterfly.

تحديد مبصرة خلية الحساسية الطيفية في نموذج الحشرات من<em&gt; في فيفو</em&gt; بين الخلايا تسجيلات

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

طريقة الكهربية لالكامل خلية الجهد المشبك تسجيلات من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; المستقبلات الضوئية

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

تسجيل الكهربية لنشاط الجهاز العصبي المركزي للطور الثالث Melanogaster المورفولوجية

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is initiated by photon absorption-inducing isomerization of the chromophore, promoting conformational changes of the opsin and resulting in a second dark-stable photopigment state (metarhodopsin, M). Investigation of this bi-stable photopigment using random mutagenesis requires simple and robust methods for screening mutant flies. Therefore, several methods for measuring reductions in functional photopigment levels have been designed. One such method exploits the charge displacements within the photopigment following photon absorption and the huge amounts of photopigment molecules expressed in the photoreceptors. This electrical signal, named the early receptor potential (or early receptor current), is measured by a variety of electrophysiological methods (e.g., electroretinogram and whole-cell recordings) and is linearly proportional to functional photopigment levels. The advantages of this method are the high signal-to-noise ratio, direct linear measurement of photopigment levels, and independence of phototransduction mechanisms downstream to rhodopsin or metarhodopsin activation. An additional electrophysiological method called prolonged depolarizing afterpotential (PDA) exploits the bi-stability of Drosophila photopigment and the absorption-spectral differences of fly R and M pigment states. The PDA is induced by intense blue light, converting saturating amounts of rhodopsin to metarhodopsin, resulting in the failure of light-response termination for an extended time in darkness, but it can be terminated by metarhodopsin to rhodopsin conversion using intense orange light. Since the PDA is a robust signal that requires massive photopigment conversion, even small defects in the biogenesis of the photopigment lead to readily detected abnormal PDA. Indeed, defective PDA mutants led to the identification of novel signaling proteins important for phototransduction.

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

We present a protocol to electrophysiologically characterize bi-stable photopigments: (i) exploiting the charge displacements within the photopigment molecules following photon-absorption and their huge amount in the photoreceptors, and (ii) exploiting the absorption-spectra differences of rhodopsin and metarhodopsin photopigment states. These protocols are useful to screen for mutations affecting bi-stable photopigment systems.&#160;

الطرق الكهروفسيولوجية لقياس مستويات التصبغ الضوئي في مستقبلات ذبابة الفاكهة الضوئية

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is ...

Electrophysiological Recording of Voltage Responses of Drosophila Retinal Photoreceptors to Light Stimuli

Source: Juusola, M., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54142">Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video outlines the protocol for electrophysiological recording of photoreceptor activity in the eye of an immobilized Drosophila, enabling precise measurement of voltage changes in response to light stimuli.

التسجيل الفيزيولوجي الكهربي لاستجابات الجهد لذبابة الفاكهة المستقبلات الضوئية لشبكية العين لمحفزات الضوء

1. Recording from R1-R6 Photoreceptors 

	Always be grounded when operating the microelectrode amplifier (for example by touching the metal surface of the ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

Extracellular Recording of Electrical Activity in the Drosophila Central Nervous System

Source: Swale, D. R., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/58375">Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster.</a> J. Vis. Exp. (2018)
The video demonstrates the extracellular recording of neuronal activity from the central nervous system (CNS) of Drosophila larvae. The transected CNS is positioned in a recording chamber, and the electrical activity from a descending nerve is recorded to establish the baseline firing frequency. A test agent is then introduced, and the change in firing frequency is recorded to determine the agent&#39;s excitatory or inhibitory effect.

تسجيل خارج الخلية للنشاط الكهربائي في ذبابة الفاكهة الجهاز العصبي المركزي

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Dissect and Prepare the Larval ...

الطريقة الكهربية لالردود تسجيل بين الخلايا الجهد ل

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

الكهربية طرق تسجيل الإمكانيات متشابك من يرقات ذبابة الفاكهة من NMJ

الكهربية في تسجيل ذبابة الفاكهة الأجنة

تسجيل الكهربية من

قياس الاستجابات الفسيولوجية لل

تحديد مبصرة خلية الحساسية الطيفية في نموذج الحشرات من

طريقة الكهربية لالكامل خلية الجهد المشبك تسجيلات من

تسجيل الكهربية لنشاط الجهاز العصبي المركزي للطور الثالث Melanogaster المورفولوجية

الطرق الكهروفسيولوجية لقياس مستويات التصبغ الضوئي في مستقبلات ذبابة الفاكهة الضوئية

التسجيل الفيزيولوجي الكهربي لاستجابات الجهد لذبابة الفاكهة المستقبلات الضوئية لشبكية العين لمحفزات الضوء

تسجيل خارج الخلية للنشاط الكهربائي في ذبابة الفاكهة الجهاز العصبي المركزي