This project was supported by grants NIH NIGMS 8P41 GM103540-28 and P50-GM076516

הכנת .1 לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאי CHOK1 בצלוחיות תרבית רקמה באמצעות DMEM בתוספת 10% בסרום שור העובר ו100 IU / מ&quot;ל ​​של פניצילין 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של סטרפטומיצין. דגירה התאים בחממה humidified 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר ולאחר מכן תאי צלחת CHOK1 על מיקרו היטב בקוטר 14 מ&quot;מ בעובי של 0.16 מ&quot;מ משטח. תאי זרע לצפיפות אופטימלית להדמיה, סביב confluency 60-70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאי הלילה בשעה 37 ° C, 5% CO 2. שוטף את התאים שלוש פעמים בHBSS (האנק נאגר מלוח פתרון), ודגירת תאים בתמיסה המכילה 50 ננומטר של Lysotracker DND26 הירוק ו150 ננומטר של ירוק גשש טובולין. דגירה תאים לשעה 1 ב37 מעלות צלזיוס. שלב אופציונאלי: לפני הדגירה, לבצע כתם נוסף עם צבע המיטוכונדריה צביעת מטריצה ​​(25 ננומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטף את התאים שלוש פעמים בHBSS כדי להסיר כל צבע מאוגד. הוסף בינוני צמיחת DMEM טרי לפני מתאר לעצמיing התאים. </li></ol> 2 תצורות מיקרוסקופ מיקרוסקופ למעקב אחר החלקיקים המתוארים בפרוטוקול הווידאו מורכב על המסגרת של מיקרוסקופ זמין מסחרי הפוך (איור 4). מודולים עם זאת מסחריים למעקב אחר חלקיקים מסלולית 3D זמינים כעת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש השני קוהרנטית Chameleon-Ultra Ti: femtosecond מקור אור עירור לייזר Sa, עם טווח אורכי גל פלט מתכונן בין 690 ננומטר ננומטר-1,040. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שקרן הלייזר מיושרת ביציאה האחורית של מיקרוסקופ באמצעות מראות מצופה IR. קרן הלייזר מוחלשת באמצעות צלחת חצי גל מסתובבת ואחריו מקטב ליניארי קלציט. להחליש את הקרן, כך שההספק הממוצע במדגם הוא בין mW 0.5 ו2. הערה: קרן הלייזר באה לידי ביטוי על ידי זוג מראות ומונעות גלונומטר מנוע המאפשרות שליטה על המיקום והמסלול של הקרן הממוקדת במטוס המדגם. בתצורה אופיינית קרן לייזר collimated יציאה של מראות גלונומטר מורחבת (10X) עוברת דרך הרחבה קרן, לפני שנכנסת לחלק האחורי של מטרת מיקרוסקופ לאחר ההשתקפות במראה dichroic קצר לעבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את אור פלואורסצנטי מהמדגם על ידי הצבת מטרה מספרית מים גבוהות צמצם (60X, NA 1.2) לתוך נתיב האור. בחר קוביית מסנן הקרינה על פי אורכי גל הפליטה הרצויים בכל תצורת ערוץ אחד או שתיים. מעסיק מסנני bandpass הפליטה כדי לבחור את טווח הספקטרום של הקרינה הנפלטת נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המדגם על במה ממונעת, ולהתאים את התנועה העדינה של מטרת מיקרוסקופ באמצעות piezo-בקר אובייקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכוון את האור מקוביית המסנן לתוך צינורות מכפיל שבו האות מופלה ונשלחו לכרטיס רכישת נתונים I / O דיגיטלי. הערה: מחשב שנוצר צורות גל הם הפלט האנלוגי של I / O הכרטיס והם provided לסורקים לשלוט אלקטרוניקה. קלט ספירת פוטון מהמכפיל ואות הפלט לסורקים נמדד ונשלט באמצעות כרטיס קלט / פלט על ידי המעבדה לתוכנת Dynamics הקרינה SimFCS. </li></ol> .3 הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את התאים על הבמה ולהתמקד באמצעות תאורת אור מועברת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור להדמית סריקת סריקה לזהות את התאים ששלבו את הצבע וכדי להמחיש את microtubules הבסיסי. זהה את האזור הראשוני שבו תנועת שלפוחית ​​היא הווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע ששלפוחית ​​בודדת מזוהה, להגדיר את הפרמטרים למעקב ההקפה הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הרדיוס של המסלול כדי להגדיר את הגודל של הסריקה המעגלית בהתאם לגודל של החלקיקים במעקב. לפולט נקודה, להגדיר את הרדיוס של המסלול שווה למותנים של פונקצית מורחים פוינט (כוחות הביטחון הפלסטיניים) של קורה העירור על מנת למקסם את הרגישות ותגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את צירילהרחיק כדי להגדיר את המרחק בין שני המסלולים המבוצעים בתרגום עמדת החלקיקים לאורך הכיוון הצירי. הגדר את המרחק הצירי ל1.5-3 פעמים המותניים כוחות הביטחון הפלסטיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הזמן להתעכב בהתאם לבהירות של החלקיקים כדי להגדיר את המשך הזמן על כל נקודה של המסלול, שגם יקבע את שיעור הלבנת תמונה. השתמש להתעכב זמן בין 10-100 μsec. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מספר נקודות בכל מסלול ל64 או 128 להניב תקופות מסלול בצו של 4-32 אלפיות שני ולספק רזולוציה גבוהה זמנית לקביעת עמדת החלקיקים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את DC אות לקזז נשלחה למראות כדי למרכז את הקרן על החלקיק דרך ממשק המשתמש הגרפי באמצעות בחירת סמן בדימוי שנסרק סריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל לעקוב אחר על ידי מעבר למצב מיקרוסקופ מסריקת הדמיה לסריקה מסלולית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את אוסף המשוב ונתונים. </li></ol> .4 Trajectניתוח אורים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנה כדי להציג את הקרינה שנאסף בכל נקודה לאורך המסלול ובכל נקודה בצורה של &quot;שטיח עוצמה &#39;זמן. העצמה שנאסף לאורך השטיח מספקת מידע על האינטראקציה של החלקיקים עם אובייקטים בהירים אחרים. להשתמש בתוכנה כדי להציג את שני מידע המסלול (כלומר עקירת DC לאורך הזמן של x, y וסורקים של -piezo z), כמו גם את עוצמת הקרינה שנאספו מהצינור מכפיל לאורך זמן בצורת סדרת זמן של. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בייצוג סדרת הזמן ומידע &#39;שטיח עוצמה&#39; כדי לבחור רק אזור של עניין במסלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בתוכנה כדי להציג הקרנת 2D של החלק הנבחר של מסלול החלקיק. בחר את הפקדים המתאימים לצבע קוד המסלול בהתאם לעוצמת הקרינה של חלקיקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את האפשרות להציג pמסלול מאמר ב3D, וצבע קוד אותו בהתאם לעוצמת הקרינה. סובב את המסלול ב3D באמצעות הפקדים כדי להמחיש את התכונות של תנועת הליזוזום לאורך microtubule. </li></ol>

<ol>
	<li>So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+photon+excitation+fluorescence+microscopy.">Two photon excitation fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).</li><li>Dupont, A., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+three+dimensional+single+particle+tracking.">Nanoscale three dimensional single particle tracking.</a> Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).</li><li>Estrada, L. C., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+nanometer+images+of+biological+fibers+by+directed+motion+of+gold+nanoparticles.">3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles.</a> Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).</li><li>Kis-Petikova, K., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distance+measurement+by+circular+scanning+of+the+excitation+beam+in+the+two+photon+microscope.">Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope.</a> Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).</li><li>Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3+D+particle+tracking+in+a+two+photon+microscope+application+to+the+study+of+molecular+dynamics+in+cells.">3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells.</a> Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).</li><li>Lund, F. W., Wustner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+single+particle+tracking+and+temporal+image+correlation+spectroscopy+for+quantitative+analysis+of+endosome+motility.">A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility.</a> Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).</li><li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+Neurodegenerative+Pathology+via+Neuron+to+Neuron+Transmission+of+beta+Amyloid.">Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid.</a> Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).</li><li>Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+live+cell+and+superresolution+microscopy+reveals+cargo+transport+dynamics+at+microtubule+intersections.">Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).</li><li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosome+maturation.">Endosome maturation.</a> Embo Journal. 30, 3481-3500 (2011).</li><li>Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+particle+tracking+on+the+two+photon+microscope.">3D particle tracking on the two photon microscope.</a> Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).</li><li>Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+response+to+near-infrared+femtosecond+laser+pulses+in+two+photon+microscopes.">Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes.</a> Optics Letters. 22, 135-136 (1997).</li><li>Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+motors+at+the+intersection+of+trafficking+and+transport.">Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport.</a> Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).</li><li>Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+directed+molecular+motion+in+the+nuclear+pore+complex+of+live+cells.">Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

למרות ההתקדמות העצומה בטכניקות הקרינה מיקרוסקופיה וinstrumentations בשנים האחרונות, להשגת מסלולים של חלקיקי ניאון בשלושה ממדים עם רזולוציה גבוהה זמנית נשאר אתגר בתחום. אם רזולוציה גבוהה זמנית הושגה חלקיקי מעקב בשני ממדים, הרחבה לכיוון הצירי בדרך כלל מביאה לירידה דרסטית בתגובת התדר של המערכת 10. בסרטון-פרוטוקול זה אנו מתמקדים ביישום ההפגנתי של מעקב חלקיקים בודדים בשלושה ממדים בתוך תא חי עם רזולוציה גבוהה זמנית (32 msec בניסוי זה) באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים. ההתקנה הנדרשת לביצוע ניסוי כזה היא בדרך כלל זמינה למעבדות המיקרוסקופיה סריקת לייזר. שני מכשיר התוספות למעקב מסלולית 3D, כמו גם את תוכנת השליטה זמינות בשוק, לcommerciaמיקרוסקופי סריקת לייזר l כמו אלה המיוצרים על ידי אולימפוס. השימוש במקור פעמו גבוה כוח לייזר אינפרא אדום, שבו זמין, יש יתרון בעיצוב של ההתקנה הניסיונית שכן הוא אינו דורש דה סריקה של הקרינה הנפלטת. יתר על כן זה הודגם בעבר כי קרינת אינפרא אדום היא שפירה יותר לכיוון התא, בתנאים מסוימים 11, בהתחשב בהפחתה של מקרינת מיקוד וצילום הלבנה. למרות מעקב מהיר של חלקיקי ניאון בשני ממדים יכול להתבצע באמצעות מצלמה רגישה, בהעדר כל מידע תלת ממדים יכול להיות לעתים קרובות מגביל בפרשנות משמעות biophysical של מידע המסלול. לדוגמא, שלפוחית ​​נעה לאורך microtubule לעתים קרובות נתקלת באזורי צומת microtubules 8,12. במצב זה, השימוש בטכניקת מעקב 3D מתגברת על המגבלה של שימוש בתחזיות 2D של מבנה 3D. בשל התגובה של מכשיר piezo nanopositioner המטרה שלנו הזמן, תקופה של התנועה בציר z מוגבלת לכ -30 msec, ואילו בx, y כיוונים זה יכול לרדת לכמה אלפיות. דיוק הלוקליזציה של שיטת מאזניים כאות ל4,5 יחס רעש. ההגבלה הנראית לעין היחידה של השיטה, כלומר האובדן של ראיה גלובלית של הסביבה של החלקיקים, היא מתוגמל על ידי האפשרות של שחזור שטיח עוצמת זמני 13, התחקות את ההיסטוריה של האינטראקציות של חלקיקי ניאון עם מקורות ניאון שכנים, מוצגות או זהה או פליטה ספקטרליים שונה. אנו מראים כי התנועה של יזוזומים, שלפוחית ​​שעוברות בבימוי תנועה לאורך microtubules, מופעל על ידי שני kinesins או dyneins, ניתן בעקבות בתוך תא חי לאחר מכתים את השימוש בצבע זמין באופן מסחרי. לאחרונה, מעקב 2D של יזוזומים היה קורבמצב רוח מרומם להדמיה ברזולוציה הסופר של רשת microtubule, במאמץ לגילוי המסלולים שהשלפוחית ​​לקחת בצמתים microtubule-microtubule 8. מסלולי 3D של יזוזומים להציג התנהגות מורכבת יותר מאשר תנועה חד כיווני. למרות שממוצע בבימויו תנועה יכולה להיות שנצפתה, כיפוף, פיתול וסיבוב אפשרי לאורך הצינוריות ניתן לצפות ממסלולים אלה. אנו זיהינו שני שלבים קריטיים בביצוע ניסויים אלה: ראשית, יש צורך להשיג צפיפות תיוג של יזוזומים שהם באותו הזמן גבוה מספיק כדי לקבל חלקיקים מוכתמים במאור פנים, וכי באותו הזמן מספק צפיפות של חלקיקים נמוכים מספיק כדי לאפשר מעקב של חלקיקים בודדים. במקרה של שני חלקיקי מעבר, מיקרוסקופ יכול לעבור מחלקיק אחד למשנו אחד תוך מעקב. השלב הקריטי השני נוגע לבחירה של פיקסל להתעכב הזמן, המאפשר איזון סביר להיותמפריד בין גבוהה יחס אות לרעש ומהירות מעקב. ראינו כי מהירות מעקב בצו של 32 אלפיות שניים בכל מחזור מעקב היא בדרך כלל מספיק כדי ללכת ביזוזומים עוברים תנועה מהירה בבימויו במהירויות מתחת מיקרומטר 1 / sec. לסיכום, מעקב מסלולית מאפשר למדוד בשלושה ממדים ועם רזולוציה זמנית של &lt;40 msec התנועה תאית של שלפוחית ​​שכותרתו fluorescently. יש המעקב מסלולית 3D הפוטנציאל להיות מועסק בעתיד למחקר של תהליכים שונים מאוד דינמיים סלולריים כגון המחקר של דינמיקת הכרומטין בזמן אמת שעתוק ודיפוזיה של חלקיקי plasmonic במדיום תאיים.

מספר גדול של גישות פותחו עד כה כדי לעקוב אחר חלקיקי ניאון בשלושה ממדים באמצעות מיקרוסקופ. רוב הגישות מסתמכות על השימוש במצלמות מהירות, מתאימות באופן אידיאלי למעקב בשני ממדים, בשילוב בדרך כלל עם שינויים מותאמים אישית של אופטיקה הפליטה של ​​מיקרוסקופ כדי להשיג מעקב בכיוון הצירי. מיקרוסקופי סריקת לייזר (או confocal או שני פוטונים) כמקובל יכול לעקוב אחר חלקיקי ניאון על ידי ביצוע רצף של z-ערימות זמן, למרות שתהליך זה הוא בדרך כלל זמן רב, ומניב רזולוציה זמן סבירה (10 Hz) רק אם במעקב החלקיקים הוא המשיך במרכז אזור הדמיה סריקה קטן על ידי מנגנון משוב פעיל 2. הרעיון של נעילה לחלקיקים הוא הבסיס של שיטת המעקב מסלולית. במקום סריקה לסרוק מסלול מעגלי מתבצע סביב חלקיקי הניאון. עוצמת הקרינה לאורךהמסלול בדיוק מתאים את עמדת חלקיקי 4. העמדה המקומית של החלקיקים לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להניע סורקי מיקרוסקופ ומחדש מרכז המסלול בעמדת החלקיקים. סורקי גלונומטר של המיקרוסקופ מונעים על ידי מתח אנלוגי. רכיב AC של מתח זה מאפשר לבצע מסלול עם קרן הלייזר הממוקדת, כלומר סינוס וקוסינוס גל פנה למראות X וסריקת Y יאפשר ביצוע מסלול מעגלי. DC לקזז של האות מקל לשנות את מיקומו של מרכז המסלול. ברגע שתקופת מסלול נקבעה ואת צורת הגל לאות AC מוגדרת, מערכת המשוב צריכה לעדכן את רכיב DC רק של האות. תוכנה מסוגלת לקרוא את אות הניאון שנאסף מהגלאים נדרשה לשלוט הסורקים וגלאים, כדי לחשב את המיקום של החלקיק ולעדכן את DC אתנקבע. למשוב מוצלח הדמיה בחירה זהירה של הפרמטרים המסלול (גודל ועיתוי) דרוש ופרמטרים אלה צריכים להיות מותאמים המבוססים על המאפיינים של חלקיקי הניאון שיש צורך לעקוב אחר. היסודות הפיזיים ומתמטיים של הטכניקה תוארו ב4,5 העבר עבור שני יישומי 2D and 3D. בפרוטוקול זה אנו מתארים בקצרה את רכיבי החומרה המרכזיים של ההתקנה, ובפירוט רב יותר נדרשים הבחירה של הפרמטרים והכנת המדגם לניסוי טיפוסי מאפשר לנו הבא לעקירתם של הליזוזום ברזולוציה גבוהה זמנית בתוך תא חי.

<table><tbody><tr><td>Lysotracker DND 26</td><td>Life Technologies</td><td>L-7526</td><td></td></tr><tr><td>Tubuline tracker Green</td><td>Life Technologies</td><td>T34075</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker RED</td><td>Life Technologies</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>Coherent Chamelon- ultra II TI</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glan Taylor Calcite Polarizer</td><td>Melles Griot</td><td>03PTA001</td><td></td></tr><tr><td>Galvanometer-motor mirror</td><td>Cambridge Technologies</td><td>M 6350</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic mirror</td><td>Chroma Technologies</td><td>700 DCSPXR</td><td></td></tr><tr><td>Motorized stage</td><td>ASI</td><td>MS2000</td><td></td></tr><tr><td>Piezo&amp;nbsp;</td><td>PI</td><td>P721-LLQ</td><td></td></tr><tr><td>Photomultiplier tube</td><td>Hamamatsu</td><td>H7422P-40</td><td></td></tr><tr><td>Data acquisition card</td><td>IO tech</td><td>PCI 1128-4000</td><td></td></tr><tr><td>Imaging software</td><td>LFD</td><td>Global for images-SimFCS</td><td></td></tr></tbody></table>

3d orbital tracking in a modified two-photon microscope: an application to the tracking of intracellular vesicles

מטרת פרוטוקול וידאו זה היא לדון כיצד לבצע ולנתח ניסוי מסלולית ניאון תלת ממדי מעקב אחר חלקיקים באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים שונה 1. בניגוד לגישות קונבנציונליות (סריקה סריקה או שדה רחב המבוסס על ערימה של מסגרות), המעקב מסלולית 3D מאפשר למקם ופעל עם מרחבית גבוהה (10 דיוק ננומטר) ורזולוציה של זמן (תגובת תדר 50 הרץ) עקירת 3D של חלקיקי ניאון נעו על אורך קשקשים של מאות מיקרונים 2. השיטה מבוססת על אלגוריתם משוב ששולט בחומרה של מיקרוסקופ סריקת לייזר שני פוטונים על מנת לבצע מסלול מעגלי מסביב לאובייקט להיות במעקב: מנגנון המשוב ישמור את אובייקט הניאון במרכז על ידי שליטה על התזוזה של קרן הסריקה 3-5. כדי להדגים את היתרונות של טכניקה זו, אנחנו אחרי אברון זז מהר, הליזוזום, בתוך אלתא iving 6,7. תאים היו מצופים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, ומוכתם באמצעות צבע מסחרי הליזוזום. אנו דנים בקצרה את תצורת החומרה ובפירוט רב יותר את תוכנת שליטה, לבצע ניסוי מעקב מסלולית 3D בתוך תאי חיים. אנו דנים בפירוט הפרמטרים הנדרשים על מנת לשלוט במיקרוסקופ הסריקה ולאפשר התנועה של האלומה במסלול סגור סביב החלקיקים. אנו מסיקים על ידי המדגימים כיצד שיטה זו ניתן להשתמש ביעילות כדי לעקוב אחר התנועה מהירה של הליזוזום שכותרתו לאורך microtubules ב3D בתוך תא חי. יזוזומים יכולים לנוע במהירויות בטווח של 0.4-0.5 מיקרומטר / sec, בדרך כלל מוצגות תנועה בבימויו לאורך רשת microtubule 8.

על פי פרוטוקול זה מעקב אחר חלקיקים מהירים 3D יחיד יכול להתבצע בתוך תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים שונה כדי לעקוב אחר התזוזה של יזוזומים שכותרתו fluorescently. הניסוי בוצע מתחקה אחרים הליזוזום מבודד נע בתוך התא לאחר תהליך התבגרות endosome 9. יזוזומים היו מוכתמים באמצעות צבע ירוק ניאון ונרגש ב930 ננומטר ניצול עירור 2 פוטונים. הנתונים שלנו מראים שזה אפשרי להשיג x, y, z מסלולי תזוזה עם רזולוציה זמנית של 32 אלפיות שניים (איור 1 א). ניתוח השטיח מציג את עוצמת נרשמה לאורך כל מסלול לאורך הזמן (איור 1b). במהלך (איור 2 א) מעקב העצמה המשולבת של הקרינה הנפלטת ניתן להקליט. מסלול 3D המשוחזר מציג תנועה בבימויו, כפי שניתן לצפות משלפוחית ​​שנעה על רשת microtubule.dditionally, ניתן לתאם את מסלול 3D לתמונת סריקת סריקה של האזור (איור 2b) שמסביב. זה מאשר את התנועה של החלקיקים לאורך הכיוון של חבילת microtubule. התאים היו מוכתמים בנוסף עם סמן אדום למיטוכונדריה כדי להקליט אינטראקציה סופו של דבר השלפוחית ​​עם אברונים אלה במהלך תנועתם. ניתן לתאם את מסלול 3D של החלקיקים בתוך התא (איור 3 א) לשטיח העצמה שנרשם מפליטת הקרינה Mitotracker (איור 3 ב). זה מאפשר לנו להקליט את אינטראקציות הקרבה של השלפוחית ​​עם רשת המיטוכונדריה כפונקציה של מיקומם בתוך התא. שיא הפליטה שנרשם ב&quot; ערוץ מיטוכונדריה &quot;לא נותן מידע פונקציונלי על דרך אברונים אינטראקציה. זה יכול לספק מידע רק בזמן של האינטראקציה שלהםובמעקב המיקום המרחבי היחסי של אובייקט הניאון ביחס לחלקיקים. מיקום יחסי זה מופק מהזווית בתוך המסלול שבו שיא הפליטה נרשם. ייצוג סכמטי של מיקרוסקופ שמשמשים לביצוע ניסוי זה ניתן לראות באיור 4. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/51794/51794fig1highres.jpg" /> איור 1 עקירה לעומת מסלולי זמן ושטיח עוצמה. ) x, עקירת Y ו Z הליזוזום לעומת עקבות זמן. ב) מסלול העצמה (העצמה שנאסף לאורך כל ציר אנכי מסלול המעגלי היא הזמן כלומר) מספקת מידע על סביבת הקרינה של החלקיקים. כתמים בהירים מחוץ לקופסה מתאימות לאינטראקציות של החלקיקים עם אובייקטים בהירים אחרים, וקשורים לקפיצות במסלול כה<html> מסלולי דואר מחדש מרכזים במקור הקרינה הבהיר. האזור התאגרף מתאים לחלק מהמסלול בין שתי קפיצות. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/51794/51794fig2highres.jpg" /> איור 2 בעקבות מסלול 3D של הליזוזום. ) שחזור 3D של חלק ממסלולו של הליזוזום נאסף באמצעות מעקב אחר חלקיקים. המסלול הוא צבע מקודד לעוצמת הקרינה שנאספו מהחלקיקים (אדום, גבוה; כחולה, ספירת פוטון נמוכה). קשקשי צירים נמצאים בננומטר. שימו לב כי x, y, z יש צירי טווחים שונים. הקרנת 2D ב) למסלול 3D, בו מוצגות כיסוי של המסלול על גבי microtubule צילם בסריקה לסרוק מייד לאחר המסלול נאסף. ג) המיטוכונדריה מוכתם בMitotracker . מחדש 3 &quot;src =&quot; / קבצים / ftp_upload / 51,794 / 51794fig3highres.jpg &quot;/&gt; איור 3 הרחבת המעקב מסלולית ליותר מערוץ אחד (עירור ב 930 ננומטר). א) מסלול 3D של הליזוזום בתוך התא. שטיח עוצמה בערוץ הירוק (הקרינה שנאספו באפיק זה ב) משמש למעקב). שטיח עוצמה במסלול האדום, שבו המיטוכונדריה היו מוכתמת במטריצת ניאון אדומה ג) צבע ממוקד. האזורים שבם המסלול מקבל במגע עם מיטוכונדריה (ראשי החץ) מופיעים כבליטות עוצמה בשטיח, כמו הקרן במסלול סביב הליזוזום חוצה לתוך המטריצה ​​של המיטוכונדריה. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/51794/51794fig4highres.jpg" /> איור 4 שרטוטים של ההתקנה הניסיונית: שונה מיקרוסקופ שני פוטונים. ייצוג סכמטי של לייזר ההגדרה: Ti 2-Photon: לייזר Sa עם ננומטר טווח 690-1,040 היה לנוed, מקטב והחצי waveplate משמש לשליטה כוח העירור. כל הפריטים האחרים המופיעים בדמות שימוש בקיצורים שצוינו. אנו משמשים מטרת 60X עם NA של 1.2.

Watch this Scientific Journal Video about 3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles at JoVE.com

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

3d-orbital-tracking-modified-two-photon-microscope-an-application-to

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K Views.  University of California, Irvine. In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope. 

Video: 3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

ויזואליזציה של Endosome Dynamics בחי מסוף עצב עם דימות פלואורסצנטי ארבעה ממדים

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Neuroscience

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of embryogenesis, these organelles undergo dramatic movements powered by actin-based cytoplasmic streaming and motor-driven trafficking along microtubules. The development of a multitude of small, organelle-specific fluorescent probes (FPs) makes it possible to visualize a wide range of different lipid-containing structures in any genotype, allowing live imaging without requiring a genetically encoded fluorophore. This protocol shows how to inject vital dyes and molecular probes into Drosophila embryos to monitor the trafficking of specific organelles by live imaging. This approach is demonstrated by labeling lipid droplets (LDs) and following their bulk movement by particle image velocimetry (PIV). This protocol provides a strategy amenable to the study of other organelles, including lysosomes, mitochondria, yolk vesicles, and the ER, and for tracking the motion of individual LDs along microtubules. Using commercially available dyes brings the benefits of separation into the violet/blue and far-red regions of the spectrum. By multiplex co-labeling of organelles and/or cytoskeletal elements via microinjection, all the genetic resources in Drosophila are available for trafficking studies without the need to introduce fluorescently tagged proteins. Unlike genetically encoded fluorophores, which have low quantum yields and bleach easily, many of the available dyes allow for rapid and simultaneous capture of several channels with high photon yields.

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

In the early Drosophila embryo, many organelles are motile. In principle, they can be imaged live via specific fluorescent probes, but the eggshell prevents direct application to the embryo. This protocol describes how to introduce such probes via microinjection, and then analyze bulk organelle motion via particle image velocimetry.

הדמיה של סחר תלוי-שלד ציטוסקלטון של אברונים המכילים שומנים בעוברי דרוזופילה

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Developmental Biology

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

פרוטוקול לצורך מעקב בזמן אמת 3D חלקיק יחיד

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

כימות של Endosome ו Lysosome Motilities ב נוירונים תרבותיים באמצעות בדיקות פלואורסצנטי

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

אין ויוו מעקב אחר בתחנת האוטובוסים Presynaptic עצבים מוטוריים דרוזופילה מולקולה בודדת

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. Furthermore, despite progress in understanding postsynaptic MTs, much less is known about the contributions of presynaptic MTs to neuronal morphogenesis. In particular, studies of in vivo MT dynamics in Drosophila sensory dendrites yielded significant insights into polymer-level behavior. However, the technical and analytical challenges associated with live imaging of the fly neuromuscular junction (NMJ) have limited comparable studies of presynaptic MT dynamics. Moreover, while there are many highly effective software strategies for automated analysis of MT dynamics in vitro and ex vivo, in vivo data often necessitate significant operator input or entirely manual analysis due to inherently inferior signal-to-noise ratio in images and complex cellular morphology. &#160;To address this, this study optimized a new software platform for automated and unbiased in vivo particle detection. Multiparametric analysis of live time-lapse confocal images of EB1-GFP labeled MTs was performed in both dendrites and the NMJ of Drosophila larvae and found striking differences in MT behaviors. MT dynamics were furthermore analyzed following knockdown of the MT-associated protein (MAP) dTACC, a key regulator of Drosophila synapse development, and identified statistically significant changes in MT dynamics compared to wild type. These results demonstrate that this novel strategy for the automated multiparametric analysis of both pre- and postsynaptic MT dynamics at the polymer-level significantly reduces human-in-the-loop criteria. The study furthermore shows the utility of this method in detecting distinct MT behaviors upon dTACC-knockdown, indicating a possible future application for functional screens of factors that regulate MT dynamics in vivo. Future applications of this method may also focus on elucidating cell type and/or compartment-specific MT behaviors, and multicolor correlative imaging of EB1-GFP with other cellular and subcellular markers of interest.&#160;

This study presents a noninvasive intravital neuronal imaging strategy combined with a new software strategy to achieve automated, unbiased tracking and analysis of in vivo microtubule (MT) plus-end dynamics in the sensory dendrites and the neuromuscular junctions of Drosophila.

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function critically in cell motility and signaling. Since cilia are incapable of synthesizing their own protein, nearly 200 unique ciliary proteins need to be trafficked between the cytosol and primary cilia. However, it is still a technical challenge to map three-dimensional (3D) locations of transport pathways for these proteins in live primary cilia due to the limitations of currently existing techniques. To conquer the challenge, recently we have developed and employed a high-speed virtual 3D super-resolution microscopy, termed single-point edge-excitation sub-diffraction (SPEED) microscopy, to determine the 3D spatial location of transport pathways for both cytosolic and membrane proteins in primary cilia of live cells. In this article, we will demonstrate the detailed setup of SPEED microscopy, the preparation of cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins, the real-time single-molecule tracking of individual proteins in live cilium and the achievement of 3D spatial probability density maps of transport routes for ciliary proteins.

Recently we mapped the three-dimensional (3D) spatial locations of transport routes for various proteins translocating inside primary cilia in live cells. Here this paper details the experimental setup, the process of biological samples and the data analyses for the 3D super-resolution fluorescence imaging approach newly applied in live primary cilia.

יישום של מיקרוסקופיית מהירות רזולוציה סופר מהיר ב ריסי העיקרי בשידור חי

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

Biology

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

4D מיקרוסקופ של שמרים

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often require indirect methods due to their small diameter (40-250 nm), which is beneath the diffraction limit of typical light microscopy. We have developed a super-resolution microscopy-based visualization of EVs to bypass the diffraction limit in both two and three dimensions. Using this approach, we can resolve the three-dimensional shape of EVs to within +/- 20 nm resolution on the XY-axis and +/- 50 nm resolution along the Z-axis. In conclusion, we propose that super-resolution microscopy be considered as a characterization method of EVs, including exosomes, as well as enveloped viruses.

Direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) is used to bypass the typical diffraction limit of light microscopy and to view exosomes at the nanometer scale. It can be employed in both two and three dimensions to characterize exosomes.

מיקרוסקופיה ישירה לשחזור אופטי סטוכאסטי של שלשלות חוץ-תאיות בשלושה ממדים

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Visualization of Vesicle Motilities in Neurons Using Fluorescence Imaging

Source: Tsuruta, F., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/55488">Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates how neuronal vesicles are labeled with specific fluorescent proteins to visualize their movement. First, a plasmid coding for a fluorescent protein is incubated with a transfection agent and then introduced into a culture of neurons. Subsequently, images of the neurons are acquired and analyzed to track the vesicles&#39; movement.

הדמיה של תנועתיות שלפוחית בתאי עצב באמצעות הדמיה פלואורסצנטית

1. Imaging Vesicle Motility

	Prepare the plasmids that will label each type of vesicle. For instance, use EGFP-Rab5 for early endosomes, EGFP-Rab7 for ...