إنشاء نماذج للفئران تحاكي العلاجات الهرمونية المؤكدة للجنس

يصف البروتوكول تطوير نموذجين للقوارض يحاكيان العلاجات الهرمونية المؤكدة للجنس من خلال الإعطاء تحت الجلد لهرمون التستوستيرون أو الاستراديول بالإضافة إلى أسيتات سيبروتيرون (المستخدم في العلاجات البشرية للأشخاص المتحولين جنسيا): تحديد الجرعات ، وتحديد المؤشرات الحيوية ذات الصلة ، وتقييم التأثيرات.

المتحولون جنسيا هم أفراد لا تتطابق هويتهم الجنسية وجنسهم المحدد عند الولادة. غالبا ما يخضعون للعلاج الهرموني المؤكد للجنس (GAHT) ، وهو تدخل طبي يسمح باكتساب خصائص جنسية ثانوية أكثر انسجاما مع هويتهم الجنسية الفردية ، مما يوفر نتائج متسقة في تحسين العديد من المتغيرات الاجتماعية والنفسية. ومع ذلك ، يستهدف GAHT أنظمة الجسم المختلفة ، ويتم تسجيل بعض الآثار الجانبية ، على الرغم من عدم تحديدها وتوصيفها بشكل كامل. لذلك ، يمكن اعتبار الأشخاص TG الذين يخضعون لGAHT مجموعة فرعية معرضة للإصابة بالسكان ويجب إيلاء اهتمام خاص في إطار تقييم المخاطر ، على سبيل المثال ، من خلال استخدام النماذج الحيوانية المستهدفة. يصف العمل الحالي الإجراءات الموضوعة لتنفيذ نموذجين من الفئران يحاكي GAHT: نموذج إزالة التأنيث (dMF) الذي يحاكي GAHT لنساء TG ونموذج التغوية الذكورية (dFM) الذي يحاكي GAHT لرجال TG. تم تنفيذ النماذج من خلال إعطاء نفس الهرمونات المستخدمة في GAHT البشري ، وهي β-استراديول بالإضافة إلى أسيتات سيبروتيرون ل dMF والتستوستيرون ل dFM ، بنفس طرق التعرض لمدة أسبوعين. يتم فحص الفئران يوميا أثناء العلاج لتقييم الحالة الصحية والسلوكيات العدوانية المحتملة. عند التضحية ، تم أخذ عينات من الدم والأنسجة المستهدفة وتخزينها للتحليل الكيميائي الحيوي والجزيئي والنسيجي. كما تم تقييم المعلمات الخاصة بالجنس ، وهي عدد المنوية وأبعاد البظر. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تحديد الأشكال الإسوية CYP450 ، التي يتم التعبير عنها حصريا و / أو تفضيليا في كبد الفئران من الذكور والإناث ، ووصفها بأنها مؤشرات حيوية جديدة للتحقق من نجاح GAHT ووضع النموذج. كما تم استكشاف إصابة الغدة الدرقية كهدف رئيسي في نظام الغدد الصماء.

يسمى التصور النفسي للفرد لكونه ذكرا أو أنثى أو لا أو كليهما أو في مكان ما بين¹ بالهوية الجنسية. يمكن أن يتطابق مع الجنس البيولوجي (متوافق مع الجنس) أو يمكن أن يكون مختلفا (المتحولين جنسيا - TG). رجل TG هو فرد يولد كأنثى ولكنه يعرف نفسه على أنه رجل. تولد امرأة TG كذكر ولكنها تعرف نفسها على أنها امرأة². تشير التقديرات إلى أن هناك في الوقت الحاضر 25 مليون شخص في جميع أنحاء العالم³ ، يعاني معظمهم من اضطراب الهوية الجنسية ، وهي حالة نفسية تتميز بعدم التوافق بين جنسهم والنوع الذي تم تعيينهم له عند^{الولادة 4} ، مما قد يؤدي إلى التمييز الاجتماعي والصعوبات في العمل والأسرة ، مما يؤدي في كثير من الأحيان إلى الاكتئاب ، القلق والتوتر⁵. لهذه الأسباب ، غالبا ما يخضع الأشخاص TG للعلاج الهرموني لتأكيد الجنس (GAHT) و / أو جراحة تأكيد الجنس. يتميز GAHT للرجال TG بإعطاء هرمون التستوستيرون (T) (الجدول 1) ، وبالنسبة للنساء TG ، هرمون الاستروجين (E2) بالإضافة إلى مضادات الأندروجينات (الجدول 2) ⁶.

عادة ما يستمر GAHT طوال حياة الفرد ، ويعمل بشكل مستمر على نظام الغدد الصماء^7،8. لذلك ، من المهم تحليل تأثير GAHT على صحة الأشخاص TG وآثاره المحتملة طويلة الأمد. علاوة على ذلك ، يتعرض الأشخاص المصابون بالثقيل التيسوري ، مثل عامة السكان ، للملوثات الكيميائية - على وجه الخصوص ، اضطرابات الغدد الصماء (ED) - التي تستهدف نظام الغدد الصماء مثل GAHT ، مما يؤدي إلى الإفراط في التحفيز⁹.

الضعف الجنسي عبارة عن مجموعة من المواد الكيميائية التي تؤثر على الكائنات الحية و / أو ذريتها عن طريق تغيير العمليات الهرمونية والتمثيل الغذائي المختلفة ، مثل إفراز الهرمونات الطبيعية وتنشيطها وتوليفها وإطلاقها وارتباطها. نظرا لأن الضعف الجنسي منتشر على نطاق واسع في البيئة ، فإن الأغذية والمنتجات للاستخدام اليومي (على سبيل المثال ، الزجاجات والحاويات البلاستيكية ، وبطانات علب الطعام المعدنية ، والمنظفات ، ومثبطات اللهب ، والطعام ، والألعاب ، ومستحضرات التجميل ، والمبيدات الحشرية ، وما إلى ذلك) يتعرض عامة السكان باستمرار طوال الحياة¹⁰. بالإضافة إلى ذلك ، حتى التعرض لجرعات منخفضة من الضعف الجنسي يمكن أن يؤدي إلى تلف الأنسجة والأعضاء ، والظاهرة الشائعة المرتبطة بالتعرض للضعف الجنسي هي حدوث تأثيرات خاصة بالجنس في كل من المختبر والبشر¹¹. على سبيل المثال ، يرتبط التعرض للمواد الملامسة للأغذية ، بيسفينول أ (BPA) ، بالمخاطر الصحية مثل الانتباذ البطاني الرحمي ومتلازمة المبيض المتعدد الكيسات لدى النساء ، فضلا عن انخفاض الخصوبة ، بسبب آثاره الاستروجين¹². في الرجال ، يمكن أن يخفض BPA المستويات ويقلل من جودة المنوية¹³. بالإضافة إلى ذلك ، ترتبط المبيدات الحشرية بزيادة خطر الإصابة بسرطان الثدي لدى النساء ومشاكل الخصوبة الكبيرة لدى الرجال¹³. حتى الآن ، لا توجد أدوات محددة متاحة لدراسة الآثار السمية للملوثات البيئية ، بما في ذلك الضعف الجنسي ، في الأشخاص TG⁹.

تهدف الدراسة الحالية إلى وصف الأساليب والمعلمات المختارة لتطوير نموذجين حيوانيين من TG: نموذج إزالة التأنيث (dMF) ونموذج التقويض والذكورة (dFM). على وجه الخصوص ، يتم تقييم اختيار مستويات الجرعة المناسبة والوقت وطريقة إعطاء الهرمونات على أساس العلاجات البشرية الحالية¹⁴. علاوة على ذلك ، يتم تحديد وتوصيف الأنسجة والمؤشرات الحيوية الوظيفية التي تحدد النماذج بشكل فريد. بالإضافة إلى ذلك ، يتم وصف فعالية العلاج وتحمله في بالإضافة إلى اختيار أنسب العلامات للاستخدام في الدراسات طويلة الأجل ، بالتفصيل جنبا إلى جنب مع التقنيات المستخدمة لهذه الأغراض.

من أجل توصيف النماذج ، يتم تحليل نقاط النهاية التالية: مستوى مصل هرمون التستوستيرون (T) (أفضل مؤشر حيوي لتقييم نجاح GAHT في كلا النموذجين^9،15) ؛ مستوى مصل الاستراديول (E2) (كلا النموذجين) ؛ هرمون تحفيز الغدة الدرقية (TSH) وهرمون الغدة الدرقية (T4) (نموذج dMF); عدد المنوية (نموذج dMF) ؛ البعد البظر (نموذج dFM) ؛ التحليل النسيجي المرضي للأعضاء التناسلية والكبد والغدة الدرقية (لكلا النموذجين). بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا تحليل التعبير الجيني للأشكال الإسوية التالية لستوكروم الكبد P450 الخاص بالجنس (CYP450s ، لكلا النموذجين)^16،17: CYP2C11 (يتم التعبير عنها على وجه التحديد في الكبد الذكري) ، CYP3A18 (يتم التعبير عنها 25 مرة في كبد الذكور أكثر من الأنثى) ، CYP2C12 (يتم التعبير عنها على وجه التحديد في الكبد الأنثوي) ، و CYP2C6 (يتم التعبير عنها في الغالب في الكبد الأنثوي ، ولكنها موجودة في مستويات أقل ، أيضا في الذكر).

يتم إجراء الدراسات وفقا للتوجيه 2010/63 / EU ، والمرسوم التشريعي الإيطالي رقم 26 بتاريخ 4 مارس 2014 ، ومبادئ منظمة التعاون الاقتصادي والتنمية للممارسات المختبرية الجيدة (GLP). تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة من قبل وزارة الصحة الإيطالية (التفويض رقم 806/2021-PR). هنا ، يتم شراء 16 فأرا شابا ناضجا جنسيا من Sprague-Dawley من كلا الجنسين (304 ± 13 جم من ذكور الفئران و 190 ± 7 جم من إناث الفئران ، تتراوح أعمارهن بين 8 و 9 أسابيع) ووضعها في قفصين في ظل ظروف معملية قياسية (22 ± 0.5 درجة مئوية ، 50٪ -60٪ رطوبة نسبية ، 12 ساعة من التناوب بين الضوء الداكن مع 12-14 تغيير هواء في الساعة) مع الماء والغذاء المتاح بشكل مجاني. في جميع الأقفاص ، من أجل الإثراء البيئي لكل ، أدخل كتل قضم الخشب واستبدلها أسبوعيا.

ملاحظة: تم اختيار التي تتراوح أعمارها بين 8-9 أسابيع منذ أن يبدأ GAHT خلال فترة المراهقة (مراحل Tanner من 2 إلى 3) ، أي ما يعادل 8-9 أسابيع في القوارض ، ويستمر لفترة طويلة ، وربما طوال حياة الأشخاص TG⁹.

1. تحجيم المجموعة ورعاية

1. استخدم الذكور والإناث الشابة من ذكور وإناث فئران Sprague-Dawley (8-9 أسابيع) كنموذج لأن الفئران هي الأنواع المفضلة التي أشارت إليها منظمة التعاون الاقتصادي والتنمية (على سبيل المثال ، المبدأ التوجيهي 421 اختبار فحص السمية الإنجابية / التنموية) والأنواع الوحيدة من القوارض المقترحة والنظر فيها في المبدأ التوجيهي 407 لمنظمة التعاون الاقتصادي والتنمية (دراسة السمية الفموية لمدة 28 يوما بجرعة متكررة في القوارض ، محدثة بمعايير الكشف عن السمية المؤثرة في الحياء).
2. استخدم برنامج G * Power لتحجيم المجموعة. لكل من نماذج dFM و dMF ، حدد أربع مجموعات اختبار: مجموعة تحكم واحدة (C) وثلاث مجموعات من المعالجة بجرعات مختلفة من GAHT. قم بإجراء التحجيم بالرجوع إلى المقارنة بين مجموعتين (جرعة العلاج مقابل C) مع اختبار Mann-Whitney ، مستوى دلالة ثنائي الذيل alpha = 0.0167 (المقابل لalpha = 0.05 مع تصحيح Bonferroni المطبق على 3 مقارنات بين كل جرعة علاج و C) ، و 1-beta power = 0.80.
   1. العدد المحسوب للجرذان / المجموعات هو كما يلي:
      بالنسبة لنموذج dFM ، / المجموعة n = 4 ، وفقا ل Kinnear et ^al.18 الذي يشير بعد أسبوعين من العلاج ، المستويات التالية: في المجموعة الضابطة: 0.2 ± 0.3 نانوغرام / مل ، في مجموعة العلاج الهرموني: 16 ± 5 نانوغرام / مل (متوسط ± الانحراف المعياري) ، المقابلة لبعد التأثير المقاس ب كوهين د = 4.46 (تأثير كبير جدا).
      بالنسبة لنموذج dMF: / المجموعة n = 3 ، وفقا ل Gómez et ^al.19 الذي يشير بعد أسبوعين من العلاج ، المستويات التالية: المجموعة الضابطة: 1.901 ± 0.413 نانوغرام / مل ومجموعة العلاج الهرموني: 0.043 ± 0.023 نانوغرام / مل (متوسط ± خطأ معياري) المقابلة لبعد التأثير المقاس بكوهين د = 6.35 (تأثير كبير جدا).
   2. لمحاذاة النموذجين، اختر n=4 لكل جنس/مجموعة، ليصبح المجموع N = 32.
3. بعد أسبوع واحد من التأقلم ، قسم الفئران حسب الجنس إلى مجموعتين تجريبيتين (dMF و dFM ، 4 جرذان / مجموعة) ، تتكون كل منهما من C واحد (ذكر التحكم ، CM والتحكم في الإناث ، CF) وثلاث مجموعات علاجية من GAHT المختارة.
4. راقب جميع الفئران مرتين في اليوم (الساعة 8:30 صباحا و 4:00 مساء) للتحقق من الظروف الصحية العامة والعدوانية المحتملة بسبب إدارة GAHT. سجل وزن الجسم (وزن الجسم) واستهلاك العلف مرتين في الأسبوع ، باستخدام ميزان تحليلي مع وظيفة الترجيح الديناميكي المثلى لوزن المختبر.
5. في النموذج التجريبي dFM ، قم بقياس قطر البظر لجميع الفئران مباشرة قبل بدء العلاج (النقطة 0) وفي نهاية العلاج (النقطة 13) ، باستخدام مقياس رقمي للقراءات الدقيقة.
6. قم بوزن جميع قبل التضحية ، وفي نموذج dMF ، مباشرة بعد التضحية قم بإزالة البربخ من أجل إجراء تعداد المنوية.

2. اختيار الجرعة والتحضير

1. استخدم الجرعات الثلاث التالية من الهرمونات التي سيتم إعطاؤها للفئران dFM: 5 و 10.5 و 22.5 مجم / كجم في الأسبوع ، بالنسبة لنموذج dMF ، استخدم مستويات الجرعة الثلاثة المختارة التالية (DL): DL1 E2 0.045 مجم / كجم + CPA 0.2 مجم / كجم ، DL2 E2 0.09 مجم / كجم + CPA 0.2 مجم / كجم و DL3 E2 0.18 مجم / كجم + CPA 0.2 مجم / كغ.
   ملاحظة: يتم اختيار جميع الجرعات مع مراعاة الإرشادات السريرية البشرية الرئيسية المستخدمة لأفراد TG¹⁵ والبيانات المحدودة المتاحة في الأدبيات.
2. قم بإعداد جميع محاليل المخزون أسبوعيا باستخدام غطاء أمان كيميائي. امزج جميع المواد بشكل صحيح في زيت السمسم كمركبة ، مما يضمن ذوبانها الكاملة.
   ملاحظة: بالنسبة لكلا الطرازين ، استخدم حاسبة تحويل الجرعة (https://dosecal.cftri.res.in/) لإدخال الجرعة المراد تحويلها ، والأنواع التي تم تعيين الجرعة لها ، والأنواع الحيوانية ، والوزن الذي يتم تحويل الجرعة من أجله. لنموذج dFM (الجدول 3), العلاج بالهرمونات البشرية, جرعة قصوى من 100 ملغ من T أسبوعيا²⁰. الجرعة المحسوبة في الفئران هي 10.5 ملغم / كجم من T أسبوعيا. الجرعة الثانية هي 22.5 مجم / كجم أسبوعيا في الفئران¹⁸. الجرعة الثالثة هي 5 مجم / كجم في الأسبوع ، يتم تحديدها من خلال الحفاظ على عامل 2.1 بين الجرعتين المحسوبتين. للحصول على نموذج dMF ، انظر الجدول 4 ، تستند الجرعات إلى الأنظمة الموصى بها للبشر²¹ والبيانات المتاحة من خلال دراسات in vivo ^14،19،22.

3. علاج

1. قم بإجراء الإعطاء تحت الجلد ل T (لنموذج dFM) و E2 بالإضافة إلى CPA (لنموذج dMF) عن طريق الضغط على الجلد ورفعه في موقع الحقن ، وتشكيل نوع من الستائر. ثم أدخل إبرة حقنة سعة 1 مل موازية لظهر. بمجرد دخولها ، قم بحقن الحجم المطلوب ببطء (100 ميكرولتر ل T ؛ 200 ميكرولتر ل E2 + CPA)²³.
   1. عالج على النحو التالي: بالنسبة لنموذج dFM ، قم بإدارة T enanthate المذاب في زيت السمسم (السيارة) 2x / أسبوع لمدة أسبوعين (100 ميكرولتر لكل حقنة تحت الجلد من T). بالنسبة لنموذج dMF ، قم بإدارة E2 بالإضافة إلى أسيتات CPA المذابة في زيت السمسم (السيارة) 5x / أسبوع لمدة أسبوعين (200 ميكرولتر لكل حقنة تحت الجلد). تعامل مع الفئران من المجموعة C بنفس الطريقة مع السيارة فقط (زيت السمسم).

4. أخذ عينات الدم والتضحية وأخذ عينات الأنسجة

1. بعد أسبوعين من العلاج ، قبل التضحية مباشرة ، استخدم نظام التخدير الغازي وتخدير جميع. تحفيز التخدير بجرعة تتراوح من 2٪ إلى 3.5٪ إيزوفلوران في أكسجين 100٪ بمعدل 1.5 لتر / دقيقة حتى فقدان ردود الفعل في غرفة تحريض البوليسترين الشفافة. ضع الجرذ في وضع الانبطاح على وسادة التسخين ونظم جرعة الأيزوفلوران بجرعة صيانة تتراوح من 1.5٪ إلى 3.5٪ يتم إعطاؤها بواسطة قناع أنف الفئران القياسي طوال عملية أخذ عينات الدم داخل القلب.
2. قم بإعداد حقنة سعة 5 مل بإبرة 21G ، مما يزيل الفراغ. فحص القلب بالأصابع ، أدخل الإبرة بعناية في الجدار الصدري الجانبي العمودي على الجسم عند نقطة المرفقين المرنين تقريبا ، بين الأضلاع 5 و 6. بمجرد دخول الدم إلى بطين القلب ، يدخل المحقنة عن طريق الشعيرات الدموية. اسحب مكبس المحقنة ببطء وبشكل مستمر حتى يسحب الدم.
3. بعد أخذ عينات الدم ، ضع الفئران في غرفة ثاني أكسيد الكربون₂ من أجل إجراء القتل الرحيم باستخدام اختناق ثاني أكسيد الكربون₂ بمعدل ملء 30٪ -70٪ من حجم الغرفة في الدقيقة. بعد 2-3 دقائق ، تحقق من موت من خلال مراقبة التنفس ونبضات^{القلب 24}.
4. بعد التضحية ، ضع كل على طاولة التشريح في وضع ضعيف ، بحيث تكون الأرجل الأمامية متجهة لأعلى والساقين الخلفيتين متجهتين لأسفل ، وثبتها بالمسامير. يرش بطن بمحلول مطهر.
5. استئصال الأعضاء التالية: الخصيتين والبربخ والرحم والمبيض والكبد والغدة الدرقية. قم بوزنها وتخزينها في أنابيب سعة 50 مل مع 35 مل من الفورمالين المخزن بنسبة 10٪ (جميع الأعضاء) أو محلول Bouin (الخصية فقط) أو اجمعها في أنابيب مبردة (عضو / أنبوب) وقم بتجميدها على الفور في النيتروجين السائل (للتخزين عند -80 درجة مئوية).
   1. أولا ، قم بقص الجلد بمقص على خط الوسط ، من العانة إلى الجزء العلوي من البطن. قم بعمل قطعتين جانبيتين على القفص الصدري وعكس الجلد على جانبي الشق لكشف الأحشاء الصدري.
   2. إزالة الأعضاء التناسلية أولا. في ذكور الفئران ، قم بإزالة الخصيتين ، الأعضاء المزدوجة البيضاوية الشكل الموجودة في تجويف البطن ، في الوضع داخل البطن (كيس كيس الصفن). قم بقص كيس الصفن والضغط عليه للتأكد من بروز الخصيتين ، ثم أمسكهما برفق. امسك الدهون الحشوية بكماشة ، ثم اقطع الخصيتين بعيدا عن الأحشاء بعد الاستئصال ، قم بوزن الخصيتين وتخزينهما في محلول بوين لتحليل الأنسجة المرضية.
   3. في إناث الفئران ، امسك الرحم أولا بدقة ، ثم اقطع المبايض (التي تقع في نهاية قرني الرحم) من الأنسجة الدهنية الحشوية. بعد الاستئصال ، قم بوزن المبايض.
   4. في كل من إناث الفئران والذكور ، انتقل إلى الجانب الأيمن من تجويف البطن ، حيث يوجد الكبد. الكبد هو عضو متعدد الفصوص ومن الممكن تحديد العديد من الأجزاء: الإنسي الأيسر (الأصغر) ، الجانبي الأيسر (الرئيسي) ، الإنسي الأيمن (الأصغر) ، الجانبي الأيمن (الرئيسي) ، المذنبة ، والفص المربع²⁵. أمسك الكبد بالملقط ، مع الحرص على عدم كسره. أمسك عملية الخنجري باستخدام كماشة وقطع الحجاب الحاجز تماما بالمقص.
   5. استخدم الملقط لرفع عملية الخنجري واستخراج الكبد من تجويف البطن. افصل الكبد عن الحجاب الحاجز بالمقص. بعد ذلك ، قم بوزن الكبد وتخزينه.
   6. لاستخراج الغدة الدرقية ، بمساعدة المقص ، قم بقص عمودي على طول عنق ، وقم بإزالة الجلد والعضلات ، وقم بقص نهايات القصبة الهوائية برفق ، حيث توجد الغدة الدرقية. تخزين الغدة الدرقية لمزيد من التحليل²⁶.
6. قم بإجراء تعداد المنوية كما هو موضح أدناه.
   1. بعد إزالة الخصية ، أمسك البربخ ، المتصل بالهامش الخلفي للخصية المعنية وموجود في كيس الصفن.
   2. في هذه التجربة ، يتم أخذ عينات السائل المنوي من ذيل البربخ الأيمن. في وقت التجميع ، قم بتنظيف ذيل الدهون والأنسجة الضامة باستخدام المقص ، وافصله عن الجزء المتبقي ، وضعه في طبق بتري (35 مم × 10 مم) يحتوي على 1 مل من DMEM. قص بالمقص وتتدفق باستخدام ماصة باستور لتسهيل إطلاق المحتوى.
   3. انقل كل السائل الذي تم الحصول عليه إلى أنبوب سعة 15 مل وارفع الحجم إلى 10 مل باستخدام DMEM (عامل التخفيف 1: 10 = 0.1). ماصة المحتوى للتجانس وإنشاء تعليق. بعد اهتزاز طفيف ، خذ 10 ميكرولتر من التعليق لتحميل غرفة Neubauer. قم بتحميل الكاميرا وبعد 3 دقائق من تحميل الكاميرا ، ابدأ العد.

5. مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)

1. اجمع عينات الدم (حوالي 2-5 مل لكل) في أنابيب سعة 2 مل واتركها تتخثر في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. قم بتدوير جميع عينات الدم في جهاز طرد مركزي 2x لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية و 3000 × جم.
2. الدم بالطرد المركزي له مظهر متعدد الطبقات بثلاث طبقات بألوان مختلفة. تتكون الطبقة العليا من البلازما (عادة ما تكون صفراء أو شفافة) ، الجزء السائل من الدم. قد يكون للطبقة الموجودة أسفل البلازما لون أبيض أو رمادي وهي معطف بافي. تحتوي الطبقة السفلية على خلايا الدم الحمراء ، وقد يظهر اللون أحمر غامق أو أحمر فاتح. لتحديد مستويات الهرمونات الجنسية ، اجمع مصل جميع العينات باستخدام ماصة (دون لمس طبقة المصفرة أو طبقات كريات الدم الحمراء) ، وقسمها إلى حصص (500 ميكرولتر) وقم بتخزينها عند -80 درجة مئوية.
3. في كلا النموذجين ، قم بإجراء اختبار ELISA للكشف و / أو قياس وجود البروتينات أو الأجسام المضادة أو المستضدات في العينة لتحديد الهرمونات الجنسية. استخدم الطريقة المباشرة واتبع التعليمات الخاصة بكل مجموعة ELISA. في هذه الدراسة ، تم تحديد مستويات المصل للهرمونات التالية في الفئران: E2 ، الجرذ Estradiol ELISA. T, فأر / الفئران التستوستيرون إليسا; TSH ، طقم الجرذ ELISA و T4 ، طقم الفئران ELISA.

6. التحليل النسيجي المرضي

1. تحضير الشرائح النسيجية للأنسجة وفقا للإجراءات التالية.
2. إصلاح عينات الرحم والمبيض والغدة الدرقية والكبد في وقت الاستخراج في الفورمالين المخزن 10٪ لمدة 48 ساعة على الأقل.
   تنبيه: العمل تحت غطاء كيميائي. لا تستنشق المادة / الخليط. تجنب توليد البخار / الهباء الجوي.
3. اغسل العينات تحت الماء الجاري لمدة 1 ساعة ثم قم بتخزينها في 80٪ كحول إيثيلي (C₂H₅OH) حتى المعالجة ، للحفاظ على البنية البروتوبلازمية من التغيرات الناتجة عن الموت الخلوي.
4. قم بإصلاح الخصية في محلول Bouin الذي يتكون من 15 مل من المحلول المشبع لحمض البيكريك ، و 5 مل من الفورمالين المركز (33٪ -40٪) ، و 1 مل من حمض الخليك الجليدي لمدة 48 ساعة. اغسل العينات بالكحول الإيثيلي بنسبة 80٪.
   تنبيه: العمل تحت غطاء كيميائي.
5. قم بإجراء التضمين في البارافين الصلب باستخدام معالج الأنسجة الأوتوماتيكي. في نهاية عملية التضمين ، ضع العينات في حاويات معدنية صغيرة يسكب فيها البارافين المذاب ويبرد على طبق مجمد ، لتشكيل كتل القطع. قم بتوجيههم اعتمادا على قسم القطع المطلوب.
6. بعد ذلك ، قم بقص العينات باستخدام ميكروتوم دوار. اجمع الأقسام من 5 إلى 6 ميكرومتر باستخدام فرش صغيرة ، وانشرها في الماء عند 37 درجة مئوية لبضع ثوان ، وضعها على شرائح زجاجية مجهرية. اترك الشرائح لتصريف بشكل عمودي لبضع دقائق وجففها في الفرن على حرارة 36 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل.
7. قم بإجراء تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين كما هو موضح أدناه.
   1. قم بإزالة الشرائح عن طريق غمسها في عامل المقاصة من أصل التربين (بديل الزيلين) لمدة 5 دقائق.
   2. أعد ترطيب الشرائح عن طريق غمسها من خلال السلسلة التالية من الإيثانول المتدرج. لكل محلول ، دقيقتان لكل غطس: 100٪ إيثانول ، 95٪ إيثانول ، 80٪ إيثانول ، 50٪ إيثانول ، وماء مقطر.
      ملاحظة: يمكن أن تكون نقطة توقف للبروتوكول ، ويمكن ترك الشرائح في RT في الماء لعدة ساعات. اختياريا ، يمكن أيضا تخزين الشرائح عند 4 درجات مئوية في الماء.
   3. ضع الشرائح في الهيماتوكسيلين من ماير لمدة 5 دقائق. انقلها على الفور إلى الحاوية بماء الصنبور لمدة 5 دقائق. قم بتشغيل ماء الصنبور في الزاوية الخلفية للحاوية بعيدا عن الأقسام. أفرغ الحاوية بشكل دوري حتى يختفي اللون الأرجواني في الماء.
      ملاحظة: لمنع الأقسام من التقشير من الشرائح ، لا تقم بتشغيل الماء مباشرة على الشرائح.
   4. ضع الشرائح في محلول مائي يوزين Y 1٪ لمدة دقيقتين. انقل الشرائح إلى الماء المقطر لمدة 15 ثانية. قم بتجفيف الشرائح عن طريق غمسها من خلال السلسلة التالية من الإيثانول المتدرج. لكل محلول ، 15 ثانية لكل غطس: 50٪ إيثانول ، 80٪ إيثانول ، 95٪ إيثانول.
   5. ضع الشرائح في 100٪ إيثانول لمدة 1 دقيقة وقم بتغييرها إلى إيثانول طازج 100٪ لمدة دقيقة أخرى. ضع الشرائح في عامل مقاصة من أصل التربين (بديل الزيلين) لمدة دقيقتين وقم بتغييره إلى عامل مقاصة جديد من أصل التربين (بديل الزيلين) لمدة دقيقتين أخريين. قم بإزالة شريحة واحدة في كل مرة وضع قسيمة غطاء.
   6. قم بتغطية الأقسام بوسيط التثبيت وضع غطاء في الجزء السفلي من الشريحة.
      ملاحظة: تأكد من أن وسيط التثبيت يسحب الشريحة إلى موضعها. إذا لم يكن الغطاء مسطحا ، فاضغط عليه برفق في مكانه. امسح أي وسيط تركيب زائد باستخدام منشفة ورقية.
   7. اغمس منديل التنظيف في عامل المقاصة من أصل التربين (بديل الزيلين) وامسح الجزء الخلفي من الشريحة لإزالة أي وسط متساقط. ضع الشريحة بشكل مسطح على سطح صلب متحرك ، مثل قطعة من الورق المقوى. أضف قسيمة تغطية إلى جميع الشرائح المتبقية كما هو موضح في الخطوة 6.7.6. اترك الشرائح تجف ووسط التثبيت يتماسك عند RT في غطاء المحرك.
      تنبيه: العمل تحت غطاء كيميائي.
8. بعد التلوين ، قم بتغطية العينات بقلة غطاء وتقييمها باستخدام المجهر البصري. تم وصف التغيرات النسيجية المرضية بناء على التوزيع والشدة والخصائص المورفولوجية.
9. قم بإجراء تسجيل الإصابات بشكل شبه كمي ، باستخدام مقياس تقييم من 5 نقاط (0 إلى 4) ، مع الأخذ في الاعتبار شدة التغييرات بناء على المعايير التي أوضحها شاكلفورد وآخرون ²⁷ وتلخيصها على النحو التالي:
   الصف 0: لا تغيير
   الصف 1: الحد الأدنى للتغيير. التأثير بالكاد مرئي على الأنسجة. صغيرة ونادرة. يؤثر على جزء من الأنسجة أقل من أو يساوي 10٪.
   الصف 2: تغيير الضوء. يمثل تغييرا نسيجيا صغيرا. تستخدم هذه الدرجة عندما يظهر النسيج أو هيكله تغيرا في الحجم بين 11٪ و 20٪.
   الصف 3: تغيير معتدل. التغيير واضح في الأنسجة. تشير الدرجة إلى وجود اختلافات بين 21٪ -40٪ من الأنسجة أو هيكلها
   الصف 4: تغيير ملحوظ. التغيير النسيجي الساحق للأنسجة أو هيكلها. تؤثر الاختلافات على 41٪ -100٪ من الأنسجة.
10. إجراء التحليل الكمي للقياس النسيجي المورفوميتري على الرحم والمبيض والخصية والغدة الدرقية. افحص أقسام الأنسجة باستخدام نظام تحليل الصور المطبق على المجهر البصري واتبع الخطوات الموضحة أدناه.
    1. الرحم: باستخدام 2x موضوعي ، قم بقياس المساحة الإجمالية لكل مقطع عرضي من قرن الرحم الأيمن ، وعضل الرحم الخارجي والداخلي ، وتجويف الرحم. احسب مساحة بطانة الرحم وعضل الرحم والنسبة بين مساحة بطانة الرحم وعضل^{الرحم 28}.
    2. المبيض: استخدم أحد الأقسام بأكملها في الموضع المركزي للمبيض للكشف عن البصيلات في مراحل مختلفة من النمو. عد البصيلات الأولية والثانوية والجسم الأصفر والجراف والرتق باستخدام هدف 4x. قم بتصنيف البصيلات وفقا ل Fortune²⁹. بالإضافة إلى ذلك ، قم بقياس مساحة المبيض لكل عينة وكثافته المسامية (عدد البصيلات / منطقة المبيض × 100) ³⁰.
    3. الخصية: باستخدام هدف 10x ، قم بقياس 20 أنبوبا / عينة ؛ بالإضافة إلى ذلك ، قم بقياس مساحة التجويف الإجمالية ، والمساحة الإجمالية ، والقطر الطولي ، والقطر العرضي²⁸.
    4. الغدة الدرقية: قياس المعلمات التالية: كثافة البصيلات (النسبة بين عدد البصيلات ومنطقة معينة ، هدف 10x) ؛ ارتفاع الخلية المسامية غير المباشر (متوسط نسبة مساحة المسام والمنطقة الغروانية في خمسة بصيلات مختارة عشوائيا / عينة 40x هدف) ؛ متوسط نسبة مناطق الظهارة المسامية وعدد النوى (في نفس المسام للتأكد من نضوج البصيلات) ؛ ارتفاع الخلية المسامية (متوسط ارتفاع خمس خلايا في خمس بصيلات / عينة مختارة عشوائيا ، 64x الهدف) ³¹.

7. التعبير الجيني

1. بالنسبة لكلا النموذجين ، قم بإجراء تحليل التعبير الجيني باستخدام عينات الكبد المخزنة عند -80 درجة مئوية. اتبع بروتوكول تنقية الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام مجموعة ، بدءا من محللة الأنسجة الحيوانية.
   1. للحصول على محللة الكبد ، قم بطحن عينة الأنسجة (10 مجم) باستخدام minipinner ، وأضف 600 ميكرولتر من RL BUFFER (المزود مع المجموعة) إلى عينة الأنسجة ، واستمر في الطحن حتى يتم تجانس العينة.
2. مباشرة بعد الاستخراج ، قم بتحديد كمية الحمض النووي الريبي الذي تم الحصول عليه وتقييم جودته (للتمسخ أو وجود أي بقايا بروتين) باستخدام مقياس الطيف الفلوري. قم بإجراء قراءات امتصاص القياس الطيفي بأطوال موجية تبلغ 260 نانومتر و 280 نانومتر ، حيث تمتص الأحماض النووية والبروتينات على التوالي.
3. بعد تقييم تركيز الحمض النووي الريبي الكلي ، باستخدام مجموعة توليف الحمض النووي (كدنا) باتباع تعليمات الشركة المصنعة ، قم بنسخ الحجم المناسب الذي يحتوي على 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي من كل عينة إلى الحمض النووي (كدنا).
4. تحليل (كدنا) الذي تم الحصول عليه بواسطة RT-PCR.
   1. لتحليل التعبيرات الجينية للجينات ذات الأهمية ، تم تصميم بادئات أمامية وعكسية محددة لكل جين مستهدف ، وكذلك للجين المرجعي المعبر عنه بشكل أساسي نازعة هيدروجين فوسفات الجلسرالديهايد (GAPDH). استخدم تطبيق الويب Primer-BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) لاختيار أفضل البادئات التي من شأنها أن تضمن خصوصية الاقتران فقط للجين محل الاهتمام والحصول على قليل النوكليوتيدات التي يتم تصنيعها بواسطة مورد تجاري. يتم الإبلاغ عن تسلسل أزواج التمهيدي المستخدمة في الجدول 5.
   2. أعد تعليق البادئات المجففة بالتجميد بالماء المقطر الخالي من الحمض النووي الريبي بتركيز نهائي يبلغ 100 مل. استخدم مجموعة مخصصة لإجراء تحليل qPCR. قم بإجراء التفاعلات في حجم نهائي قدره 20 ميكرولتر ، مع تخفيف (كدنا) الملدن 1:40. قم بتحميل كل عينة مكررة في لوحات PCR سعة 96 بئرا.
   3. قم بإجراء تشغيل qPCR على جهاز التدوير الحراري باتباع هذا البرنامج: دورة واحدة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ؛ 40 دورة عند 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 58 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. في النهاية ، قم بإجراء دورة تفكك من 55 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية (30 ثانية / درجة مئوية) للتحقق من خصوصية المنتج المضخم. باستخدام البرنامج المخصص للجهاز، احصل على قيم دورة العتبة (عتبة الدورة، القيراط القصيري) لكل عينة. عبر عن النتائج ك ΔΔ Ct (دلتا دلتا Ct) وفقا لصيغة Pfaffl³²:
      الجين المستهدف ΔCt = التحكم في القطع المقطعي المحوسب - معالج ب CT
      الجين المرجعي ΔCt = التحكم في Ct - معالج CT
      ΔCt = ΔCt الجين المستهدف - الجين المرجعي ΔCt

8. تحليل البيانات

1. قم بإجراء إدارة البيانات باستخدام جدول بيانات. إجراء التحليل باستخدام برنامج التحليل الإحصائي. تصميم الرسومات باستخدام برامج محددة.
2. تمثيل اكتساب وزن الجسم ، واستهلاك الأعلاف ، والوزن المطلق والنسبي للأعضاء ، ومستويات هرمون الدم ، وبيانات قياس الأنسجة ، وبيانات التعبير الجيني كمتوسط ± الانحراف المعياري. قم بإجراء تحليل Kruskal-Wallis غير بارامتري ، متبوعا بمقارنات زوجية لاحقة (اختبار مان ويتني).
3. قم بتحليل البيانات النسيجية باستخدام اختبار فيشر الدقيق ثنائي الاتجاه لتحديد الاختلافات المهمة عن المجموعة الضابطة ، بما في ذلك العينات التي تم تعيينها لفئة دون أي إشارة إلى تدرجات الشدة (إجمالي حدوث الاكتشاف). استخدم اختبار اتجاه كوكران-أرميتاج لتحديد اتجاه الاستجابة للجرعة. ضع في اعتبارك الاختلافات بين المجموعات ذات دلالة إحصائية إذا كانت قيمة p < 0.05.

كما أوضح Tassinari et ^al.14 و Tammaro et ^al.33 ، أظهرت النتائج التالية نجاح GAHT على الفئران ومدى ملاءمة النماذج.

لم يتم تسجيل أي وفيات أو سلوك غير طبيعي ، مثل العدوانية ، ولم يتم ملاحظة أي علامات سريرية للسمية أو المعاناة (على سبيل المثال ، انخفاض النشاط ، والانتصاب ، والمظهر غير المريح)¹⁴.

تراكيز T في البلازما في ذكور الفئران الإناث الإناث أثناء الشبق والبروستيروكس هي 5.71 ± 0.84 نانوغرام / مل و 1.24 ± 0.29 و 0.80 ± .36 نانوغرام / مل ، على التوالي³⁴. متوسط مستوى تداول T في الفئران السليمة الغدد التناسلية هو 3.5 ± 0.5 نانوغرام / مل³⁵. تقع مستويات T و E2 المقاسة في الفئران الضابطة في كلا النموذجين في النطاق الفسيولوجي المشار إليه في الأدبيات³³. يتراوح النطاق الفسيولوجي ل E2 لإناث الفئران بين 5-140 بيكوغرام / مل³⁶. يتراوح النطاق الفسيولوجي ل E2 لذكور الفئران بين 2-175 بيكوغرام / مل³⁷.

الموديل dFM
بالنظر إلى التباين في قطر البظر ، المحسوب على أنه الفرق بين القطر المقاس في اليوم الأخير (النقطة 13) واليوم الأول من العلاج (النقطة 0) ، يتم زيادة القطر في جميع مجموعات العلاج (DL1 = 0.45 ؛ DL2 = 095 ؛ DL3 = 2.05 ملغ في T لكل إدارة) مقارنة بالمجموعة C (الجدول 6).

وكسب وزن الجسم كبير في مجموعتي DL2 وDL3 مقارنة بالمجموعة C. زاد استهلاك الأعلاف بشكل ملحوظ في مجموعة DL3 مقارنة ب C (الشكل 1).

زادت مستويات مصل T في جميع مجموعات العلاج ، ووصلت إلى نطاق المتوافق مع الجنس المقابل (C MALE = CONTROL MALE) ؛ انخفضت مستويات E2 في جميع مجموعات العلاج ، لتصل إلى نطاق المتوافق مع الجنس المقابل (الشكل 2).

انخفض وزن المبيض المطلق والنسبي في مجموعات DL2 و DL3 ، مقارنة بالمجموعة C (الجدول 7 ؛ الشكل 3) ، مع انخفاض الوزن المطلق للرحم في مجموعة DL2 (الجدول 7).

أظهر التحليل النسيجي المرضي للمبايض في مجموعة DL3 زيادة معنوية تعتمد على الجرعة في الأوعية الدموية المفرطة عند مقارنتها بالمجموعة C. أظهرت مجموعة DL3 زيادة كبيرة في عدد البصيلات الأولية والثانوية ، وانخفاضا كبيرا في بصيلات Graaf عند مقارنتها بالمجموعة C (الجدول 8).

أظهر الرحم زيادة في الأوعية الدموية فرط الدم ، بشكل ملحوظ في مجموعة DL3. يتم تقليل مناطق التجويف ومناطق عضل الرحم ومناطق بطانة الرحم وارتفاع الظهارة اللمعية في جميع مجموعات العلاج (الجدول 8).

أظهر تحليل التعبير الجيني تنظيما كبيرا للجينات الخاصة بالجنس الذكري (Cyp2C11; Cyp3A18) ¹⁷ في مجموعات DL2 و DL3 وانخفاض كبير في التنظيم للجين الخاص بالجنس الأنثوي (Cyp2C12) ¹⁴ في مجموعات DL2 و DL3 بالمقارنة مع المجموعة C (الشكل 4).

الموديل dMF
لم يتم تسجيل أي وفاة أو آثار سريرية ضارة لنموذج dMF. ينخفض عدد المنوية اعتمادا على الجرعة وإحصائيا في جميع مجموعات العلاج (DL1: 0.045 + 0.2 ، DL2: 0.09 + 0.2 ، و DL3: 0.18 + 0.2 مجم E2 + CPA) مقارنة بالمجموعة C (الشكل 5).

انخفض اكتساب وزن الجسم واستهلاك العلف بشكل ملحوظ في جميع مجموعات المعالجة (DL1: 0.045 + 0.2 ، DL2: 0.09 + 0.2 ، و DL3: 0.18 + 0.2 مجم E2 + CPA) مقارنة بالمجموعة C (الشكل 6).

تنخفض مستويات مصل T بشكل ملحوظ ، وتزداد مستويات مصل E2 إحصائيا في جميع مجموعات العلاج (DL1: 0.045 + 0.2 ، DL2: 0.09 + 0.2 ، و DL3: 0.18 + 0.2 مجم E2 + CPA) مقارنة بالمجموعة C (الشكل 7). كما هو متوقع ، لا يظهر أي فرق بين مستويات مصل T لمجموعات العلاج ومجموعة C للإناث

تزداد مستويات مصل TSH اعتمادا على الجرعة في جميع مجموعات العلاج ، بشكل ملحوظ في مجموعة DL2 ومع أهمية حدية في DL3 (p = 0.06) مقارنة بالمجموعة C (الشكل 8).

ينخفض الوزن المطلق للخصية بشكل ملحوظ في جميع مجموعات العلاج (DL1: 0.045 + 0.2 ، DL2: 0.09 + 0.2 ، و DL3: 0.18 + 0.2 مجم E2 + CPA) مقارنة ب C. لا توجد فروق في الوزن النسبي بين العلاج مقارنة بالمجموعة C (الجدول 9).

لوحظ استنفاد الخلايا الجرثومية وزيادة تنكس النبيبات في الخصيتين بطريقة تعتمد على الجرعة مع التحليل النسيجي المرضي. (DL1 ، عينة 1/4: الصف 1 ؛ DL2 ، 2/4 عينات: الصف 1 ؛ عينات DL3 ، 2/4: عينات من الدرجة 1 بالإضافة إلى 2/4: الدرجة 2) وانخفاض معتد به إحصائيا في منطقة تجويف الأنابيب في مجموعة DL3 مقارنة بالمجموعة C (الجدول 10 ؛ الشكل 9).

كشف التحليل النسيجي المرضي للغدة الدرقية عن تضخم الخلايا الجريبية مع بصيلات مركزية معبأة بإحكام وأصغر من المعتاد في جميع مجموعات العلاج (DL1: 0.045 + 0.2 ، DL2: 0.09 + 0.2 و DL3: 0.18 + 0.2 مجم E2 + CPA) مقارنة بالمجموعة C (الشكل 10). تزداد كثافة البصيلات في جميع مجموعات العلاج بشكل كبير مع زيادة عدد البصيلات. ومع ذلك ، ينخفض بعد البصيلات مع انخفاض مساحة كل من الجريب والغرويات في جميع مجموعات العلاج مقارنة ب C. لا يتأثر ارتفاع خلية الظهارة t ومساحة البصيلات (الجدول 10).

يشير تحليل التعبير الجيني إلى أن Cyp2c11 (الشكل الإسوي الخاص بالذكور) يتم تنظيمه بشكل منخفض في مجموعة DL3 و Cyp3a18 (الشكل الإسوي السائد للذكور) يتم تنظيمه بشكل كبير في جميع مجموعات العلاج (الشكل 11 أ ، ب). يتم تنظيم Cyp2c12 (الشكل الإسوي الخاص بالإناث) في جميع مجموعات العلاج ، وهو ذو دلالة إحصائية في DL1 و DL2 (الشكل 11C) ، يتم تنظيم Cyp2c6 (الشكل الإسوي السائد للأنثى) بشكل كبير في مجموعة DL2 عند مقارنتها ب C (الشكل 11 د).

الشكل 1: بيانات السمية العامة في نموذج التغوية والذكورة. (أ) زيادة وزن الجسم لإناث الفئران Sprague-Dawley التي عولجت تحت الجلد بجرعات مختلفة من هرمون التستوستيرون إينونثات 2x في الأسبوع لمدة أسبوعين: C: 0-زيت السمسم. DL1: 0.45; DL2: 0.95; DL3: 2.05 ملغ. (ب) استهلاك الغذاء من إناث الفئران Sprague-Dawley المعالجة تحت الجلد بجرعات مختلفة من هرمون التستوستيرون إينونثات 2x في الأسبوع ، لمدة أسبوعين: CF: 0-زيت السمسم. DL1: 0.45; DL2: 0.95; DL3: 2.05 مجم. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± انحراف معياري. الدلالة الإحصائية: * ص < 0.05 اختبار مان ويتني. تم تعديل هذا الرقم من¹⁴. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: مستويات مصل الهرمونات في نموذج التغوية والذكورة (dFM). التقييم الكيميائي الحيوي للهرمونات عن طريق اختبار ELISA لفئران Sprague-Dawley التي عولجت تحت الجلد بجرعات مختلفة من هرمون التستوستيرون اينونثات 2x في الأسبوع ، لمدة أسبوعين: C: 0-زيت السمسم. DL1: 0.45; DL2: 0.95; DL3: 2.05 مجم و C MALE (ذكر تحكم) 0 ملغ. (أ) التستوستيرون ، (ب) استراديول. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± انحراف معياري. الدلالة الإحصائية: * ص < 0.05 اختبار مان _ويتني. تم تعديل هذا الرقم من¹⁴. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: السمات النسيجية المرضية للمبيض. عولجت إناث الفئران المبيض Sprague-Dawley تحت الجلد 2x في الأسبوع لمدة أسبوعين مع (A) لوحة زيت السمسم 0 و (B) 2.05 مجم من هرمون التستوستيرون إينونثات. شريط المقياس 10 ميكرومتر (التكبير الأصلي: 20x ؛ صبغة الهيماتوكسيلين واليوزين). تم تعديل هذا الرقم من¹⁴. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: التعبير الجيني في نموذج التأنيث والذكورة. تحليل التعبير الجيني ل (أ) الجينات الخاصة بالذكور Cyp2c11 و Cyp3a18 و (ب) الجينات الخاصة بالإناث Cyp2c6 و Cyp2c12 عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي في كبد الفئران الأنثوية المعالجة تحت الجلد بجرعات مختلفة من هرمون التستوستيرون إينونثات 2x في الأسبوع ، لمدة أسبوعين: C 0-زيت السمسم ، DL1 0.45 ، DL2 0.95 ، و DL3 2.05 مجم. يتم تقديم البيانات كمتوسط قيم ΔΔCt ± الانحراف المعياري ، مع عينات التحكم كمعايرات و GAPDH كجين مرجعي. الدلالة الإحصائية: * ص < 0.05 اختبار مان ويتني. تم تعديل هذا الرقم من¹⁴. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: عدد المنوية. (أ) عدد المنوية لذكور الفئران Sprague-Dawley المعالجة تحت الجلد باستراديول فاليرات بالإضافة إلى أسيتات سيبروتيرون ، 5 مرات في الأسبوع لمدة أسبوعين: التحكم (C): 0-زيت السمسم ، DL1: 0.045 + 0.2 ، DL2: 0.09 + 0.2 و DL3: 0.18 + 0.2 مجم. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± انحراف معياري. الدلالة الإحصائية: * ص < 0.05 اختبار مان ويتني. (ب) صور مجهرية ضوئية لعدد المنوية في غرفة نيوباور (التكبير الأصلي 10x ؛ مساحة 1/16 مم²). وقد عدل هذا الرقم من³³. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: بيانات السمية العامة في نموذج إزالة الذكورة والأنوثة. (أ) زيادة وزن الجسم (BW) لذكور الفئران Sprague-Dawley المعالجة تحت الجلد بالاستراديول فاليرات بالإضافة إلى أسيتات سيبروتيرون ، 5 مرات في الأسبوع لمدة أسبوعين: التحكم (C): 0-زيت السمسم ، DL1: 0.045 + 0.2 ، DL2: 0.09 + 0.2 و DL3: 0.18 + 0.2 ملغ. (ب) استهلاك العلف. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± انحراف معياري. الدلالة الإحصائية: * ص < 0.05 اختبار مان ويتني. تم تعديل هذا الرقم من³³. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: مستويات مصل الهرمونات في نموذج إزالة التأنيث. التقييم الكيميائي الحيوي للهرمونات بواسطة اختبار ELISA لذكور الفئران Sprague-Dawley المعالجة تحت الجلد بالاستراديول فاليرات بالإضافة إلى أسيتات سيبروتيرون ، 5 مرات في الأسبوع لمدة أسبوعين: التحكم (C): 0-زيت السمسم ، DL1: 0.045 + 0.2 ، DL2: 0.09 + 0.2 و DL3: 0.18 + 0.2 مجم. (أ) التستوستيرون ، (ب) استراديول. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± انحراف معياري. الدلالة الإحصائية: * ص < 0.05 اختبار مان ويتني. تم تعديل هذا الرقم من³³. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8: مستويات مصل المؤشرات الحيوية للغدة الدرقية في نموذج إزالة التأنيث. التقييم الكيميائي الحيوي للهرمونات عن طريق اختبار ELISA لذكور الفئران Sprague-Dawley المعالجة تحت الجلد ب estradiol valerate بالإضافة إلى أسيتات سيبروتيرون ، 5x في الأسبوع لمدة أسبوعين: التحكم (C): 0-زيت السمسم ، DL1: 0.045 + 0.2 ، DL2: 0.09 + 0.2 و DL3: 0.18 + 0.2 ملغ. (أ) TSH ، (B) T4. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± انحراف معياري. الدلالة الإحصائية: * ص < 0.05 اختبار مان ويتني. تم تعديل هذا الرقم من³³. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 9: السمات النسيجية المرضية في الخصية. تنكس نبيبات الخصية مع استنفاد الخلايا الجرثومية في ذكور الفئران Sprague-Dawley المعالجة تحت الجلد باستراديول فاليرات بالإضافة إلى أسيتات سيبروتيرون ، 5 مرات في الأسبوع لمدة أسبوعين: التحكم (C): 0-زيت السمسم ، DL1: 0.045 + 0.2 ، DL2: 0.09 + 0.2 و DL3: 0.18 + 0.2 مجم شريط المقياس 10 ميكرومتر (التكبير الأصلي 10x ؛ صبغة الهيماتوكسيلين واليوزين). تم تعديل هذا الرقم من³³. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 10: السمات النسيجية المرضية للغدة الدرقية. تضخم الغدة الدرقية في ذكور الفئران Sprague-Dawley التي عولجت تحت الجلد بالاستراديول فاليرات بالإضافة إلى أسيتات سيبروتيرون 5x في الأسبوع لمدة أسبوعين: التحكم (C): 0-زيت السمسم ، DL1: 0.045 + 0.2 ، DL2: 0.09 + 0.2 و DL3: 0.18 + 0.2 مجم. شريط المقياس 10 ميكرومتر (التكبير الأصلي 10x ؛ صبغة الهيماتوكسيلين واليوزين). تم تعديل هذا الرقم من³³. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 11: التعبير الجيني في نموذج إزالة التأنيث. تحليل التعبير الجيني ل (أ) الجينات الخاصة بالذكور Cyp2c11 ؛ (ب) Cyp3a18 و (C) الجينات الخاصة بالإناث Cyp2c12 و (D) Cyp2c6 عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي في ذكور كبد الفئران المعالجة تحت الجلد بجرعات مختلفة من الاستراديول بالإضافة إلى أسيتات سيبروتيرون ، 5 مرات في الأسبوع لمدة أسبوعين: التحكم (C): 0-زيت السمسم ، DL1: 0.045 + 0.2 ، DL2: 0.09 + 0.2 و DL3: 0.18 + 0.2 مجم. يتم تقديم البيانات كمتوسط قيم ΔΔCt ± الانحراف المعياري ، مع عينات التحكم كمعايرات و GAPDH كجين مرجعي. الدلالة الإحصائية: * ص < 0.05 اختبار مان ويتني. تم تعديل هذا الرقم من¹⁴. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: العلاج الهرموني للرجل المتحولين جنسيا: طريقة الإعطاء والصياغة والجرعة الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: العلاج الهرموني للنساء المتحولات جنسيا: طريقة الإعطاء والتركيبة والجرعة الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 3: مستويات جرعة الهرمونات لنموذج التغوط والذكورة. مستويات الجرعة المختارة لنموذج dFM في إناث الفئران Sprague-Dawley التي عولجت تحت الجلد بجرعات مختلفة من هرمون التستوستيرون اينونثات 2x في الأسبوع لمدة أسبوعين: التحكم (C) 0-زيت السمسم; DL1 0.45 و DL2 0.95 و DL3 2.05 مجم. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 4: مستويات جرعة الهرمونات لنموذج إزالة الذكورة والأنثة. مستويات الجرعة المختارة لنموذج dMF في ذكور الفئران Sprague-Dawley المعالجة تحت الجلد باستراديول فاليرات بالإضافة إلى أسيتات سيبروتيرون ، 5 مرات في الأسبوع لمدة أسبوعين: التحكم (C): 0-زيت السمسم ، DL1: 0.045 + 0.2 ، DL2: 0.09 + 0.2 و DL3: 0.18 + 0.2 مجم. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 5: الاشعال إلى الأمام والتصميم العكسي. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 6: أبعاد البظر. لوحظ التباين في قطر البظر بالمليمترات (مم) من الفئران الإناث Sprague-Dawley عندما تم تسليم جرعات مختلفة من هرمون التستوستيرون اينونثات 2x تحت الجلد لمدة أسبوع لمدة أسبوعين 2: C 0-زيت السمسم; DL1 0.45 و DL2 0.95 و DL3 2.05 مجم. الدلالة الإحصائية: § ص < 0.05 اختبار فيشر الدقيق. # ص < 0.05 الاتجاه الخطي ؛ * ص < 0.05 اختبار مان ويتني. ن: رقم. SD: الانحراف المعياري. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 7: الوزن المطلق والنسبي للمبيض والرحم. المبيض والرحم الوزن المطلق والنسبي لإناث الفئران Sprague-Dawley التي عولجت تحت الجلد بجرعات مختلفة من هرمون التستوستيرون إينونثات 2x في الأسبوع لمدة أسبوعين: C 0-زيت السمسم ، DL1 0.45 ، DL2 0.95 و DL3 2.05 مجم. الدلالة الإحصائية: § ص < 0.05 اختبار فيشر الدقيق. ## ص < 0.01 الاتجاه الخطي ؛ * ص < 0.05 اختبار مان ويتني. ن: رقم. SD: الانحراف المعياري. تم تعديل هذا الجدول من¹⁴. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 8: البيانات النسيجية المرضية لنموذج التغوية والذكورة. نقاط النهاية النسيجية المرضية في الأعضاء المستهدفة من إناث الفئران Sprague-Dawley التي عولجت تحت الجلد بجرعات مختلفة من هرمون التستوستيرون إينونثات 2x في الأسبوع لمدة أسبوعين: C 0-السمسم ، DL1 0.45 ، DL2 0.95 و DL3 2.05 مجم. الدلالة الإحصائية: § ص < 0.05 اختبار فيشر الدقيق. ## ص < 0.01 الاتجاه الخطي ؛ * ص < 0.05 اختبار مان ويتني. ن: رقم. SD: الانحراف المعياري. تم تعديل هذا الجدول من¹⁴. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 9: الوزن المطلق والنسبي للخصيتين. الوزن المطلق والنسبي لخصيتي ذكور Sprague-Dawley المعالجة تحت الجلد بالاستراديول فاليرات بالإضافة إلى أسيتات سيبروتيرون ، 5x في الأسبوع لمدة أسبوعين: التحكم (C): 0-زيت السمسم ، DL1: 0.045 + 0.2 ، DL2: 0.09 + 0.2 و DL3: 0.18 + 0.2 مجم. الدلالة الإحصائية: * ص < 0.05 اختبار مان ويتني. N: رقم العينة ؛ SD: الانحراف المعياري. تم تعديل هذا الجدول من³³. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 10: البيانات النسيجية المرضية لنموذج إزالة الذكورة والأنثة. البيانات النسيجية المرضية للخصيتين والغدة الدرقية لذكور الفئران Sprague-Dawley التي عولجت تحت الجلد ب estradiol valerate بالإضافة إلى أسيتات سيبروتيرون ، 5x في الأسبوع لمدة أسبوعين: التحكم (C): 0-زيت السمسم ، DL1: 0.045 + 0.2 ، DL2: 0.09 + 0.2 و DL3: 0.18 + 0.2 مجم. الدلالة الإحصائية: § ص < 0.05 اختبار فيشر الدقيق. ° p = 0.08 ، * ص < 0.05 اختبار مان ويتني ؛ ## ص < 0.01 اختبار اتجاه كوكران-أرميتاج. N: رقم العينة ؛ SD: الانحراف المعياري. تم تعديل هذا الجدول من³³. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

يعد تنفيذ نماذج القوارض التي تحاكي GAHT أمرا بالغ الأهمية لدراسة القابلية المحتملة للإصابة والضعف لدى الأشخاص المصابين ب TG والنتائج طويلة المدى للعلاجات ، والتي عادة ما تستمر طوال حياتهم.

بالنظر إلى العدد النادر من الدراسات المماثلة في الأدبيات ، فإن النقطة الحاسمة في هذه التجربة هي اختيار الجرعات لتعيين النماذج. يجب أن تكون هذه الجرعات منخفضة بما يكفي لتكون متوافقة مع الإدارة طويلة الأمد في دون التسبب في آثار ضارة و / أو سمية و / أو وفاة. نقطة حرجة أخرى هي أفضل طريق للإدارة يجب اعتماده ، مع مراعاة المسار المفضل لدى البشر. في الواقع ، على الرغم من أنه في نموذج dFM ، يتم إعطاء T وفقا للممارسة السريرية في TG الرجال¹⁵في نموذج dMF ، لم يتداخل مسار الإدارة مع الممارسة السريرية في نساء TG¹⁵. هناك حاجة إلى مزيد من التجارب لإنشاء طريقة أكثر موثوقية. في الواقع ، تم تصميم نموذجي الفئران لتقليد العلاجات البشرية قدر الإمكان. أنها توفر بيانات محورية حول تأثير كل من GAHTs على العديد من وظائف الجسم ، بما في ذلك التكاثر وتوازن الغدة الدرقية والتمثيل الغذائي للكبد ، مما يملأ جزءا من الفجوة الموجودة.

يمكن تطبيق العديد من التدابير الإضافية لتحسين النموذجين وجعلهما أكثر قوة وقابلية للنقل إلى البشر. على سبيل المثال ، استخدام الإدارة تحت الجلد من خلال زرع خزانات البوليمر التي تطلق E2 أو T بطريقة يومية خاضعة للرقابة ، والتي تحاكي عن كثب بقع إفراز الهرمونات المستخدمة على نطاق واسع في الإعدادات السريرية اليوم¹⁵. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي تمديد مدة العلاج إلى محاكاة التعرض المزمن للمرضى الذين يختارون الخضوع لجي إيه تي إس بشكل أفضل.

تجدر الإشارة بشكل خاص إلى التعبير عن CYPs الكبدية الخاصة بالجنس ، والتي تستخدم لتقييم نجاح العلاجات. في الواقع ، تم تعيين هذه المعلمة وتطويرها لأول مرة في العمل الحالي وتمثل أداة قيمة لتأكيد تنفيذ النماذج.

أخيرا ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتقييم قابلية انعكاس الاضطرابات الإنجابية بسبب GAHT لتحسين الحفاظ على الخصوبة لدى الأشخاص TG الذين يقررون إنجاب أطفال³⁸.

وأعلن المؤلفون أن البحث أجري دون أي علاقات تجارية أو مالية يمكن أن تخلق تضاربا في المصالح.

اي.