Kırmızı kan hücresi antikorunun önemini tahmin etmek için kullanılacak en iyi yöntemi belirlemeye çalışıyoruz. Monosit-makrofaj testi, monosit monotabaka testinden daha hassas görünmektedir. Bu yüzden cevaplamaya çalıştığımız sorular, monosit-makrofaj testinin, kırmızı kan hücresi antikor önemini tahmin etmek için monosit monotabaka testinden daha iyi bir test olup olmadığıdır.
Hem monosit monotabaka testi hem de monosit-makrofaj testi ile ilgili deneysel zorluklar, manuel fagositoz değerlendirmesine olan ihtiyacı ortadan kaldırırken, daha hızlı tamamlamayı sağlamak için verimliliklerini optimize etmektedir. Başka bir deyişle, zorluk, bu tahlilleri yarı otomatik hale getirmeye çalışmaktır. Aslında 1980 yılında öncülük ettiğim monosit monotabaka testi, 1983 yılından beri İmmünohematoloji Referans Laboratuvarı tarafından rutin olarak kullanılmaktadır ve donör kanı bu antikorlara sahip hastalara transfüzyon yapıldığında hangi kırmızı kan hücresi oto veya alloantikorlarının hemolize neden olma potansiyeline sahip olduğuna karar vermeye yardımcı olmaktadır.
Bu nedenle MMA, tahlilde monositler kullanır, ancak antikor aracılı hemoliz tipik olarak dalak veya karaciğerdeki makrofajlardan kaynaklanır. Bu yüzden burada, bu testte birincil makrofajların kullanımının, potansiyel antikor klinik öneminin belirleyicileri olarak monositlerden daha iyi olup olmayacağını araştırıyoruz. Monosit-makrofaj testini daha kullanıcı dostu, daha hızlı ve ışık mikroskobu gerektirmeyen hale getirmeye çalışmak, ancak belki de fagositozu okumak için otomatik bir mekanizma arzu edilebilir.
Başlamak için, tam kanı RPMI-1640 Complete Medium ile seyreltin ve santrifüjleme için bir yoğunluk gradyan ortamı üzerine katmanlayın. Santrifüjleme sonrası, periferik kan mononükleer hücreleri veya PMBC'ler içeren buffy ceketi alın. Elde edilen PBMC'leri peletledikten sonra, 10 mililitre önceden ısıtılmış RPMI-1640 Komple Ortamda yeniden süspanse edin.
Monosit izolasyon işlemine başlamadan önce uygun ekipman kullanarak hücre sayısını belirleyin. Monosit izolasyon kiti talimatlarını izleyin ve numuneyi uygun boyuttaki propilen tüpe aktarın. Zenginleştirme kokteylini, numunenin mililitresi başına 50 mikrolitre konsantrasyonda numuneye ekleyin.
Numuneyi yukarı ve aşağı pipetledikten sonra, iyice karıştırmak için vorteksleyin ve numuneyi bir buz kovasında 10 dakika boyunca iki ila sekiz santigrat derecede inkübe edin. Şimdi, bu inkübasyon süresi boyunca manyetik parçacıkları 30 saniye boyunca girdaplayın. İnkübasyondan sonra, numuneye mililitre numune başına 100 mikrolitre konsantrasyonda manyetik parçacıklar ekleyin.
Numuneyi girdaplayın ve beş dakika boyunca iki ila sekiz santigrat derecede inkübe edin. Ardından, kademeli bir pipet kullanarak hacmi gerektiği gibi 2,5 mililitre veya 10 mililitreye çıkarmak için izolasyon ortamını ekleyin ve karıştırın. Daha sonra, propilen tüpü kapağı olmadan mıknatısın içine yerleştirin ve oda sıcaklığında yaklaşık 2,5 dakika inkübe edin.
Ardından, mıknatısı alın ve hücre süspansiyonunu yeni bir 5 veya 14 mililitrelik tüpe dökmek için sürekli bir hareketle ters çevirin. İzole edilmiş hücreleri RPMI-1640 Ortamında yeniden süspanse edin. Başlamak için, her makrofaj popülasyonu, M1 ve M2 için 25 mililitrelik bir şişeye beş mililitre poli-D-lizin çözeltisi ekleyin ve şişeleri en az bir saat boyunca başlıkta bırakın.
Hücre sayısını belirledikten sonra, beş mililitre RPMI-1640 Medium ekleyin, ardından önceden kodlanmış 25 mililitrelik şişeye altı monositin gücüne 10 ila beş kez tohum ekleyin. Şişeyi 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile en az iki saat inkübe edin. Kuluçka süresinin ardından, şişeyi bir kez PBS ile ve iki kez tam RPMI-1640 Medium ile yıkayın.
İstenilen hücre tipine göre şişeye 10 mililitre M1 veya M2 farklılaşma ortamı ekleyin ve hücrelerin inkübatörde altı gün boyunca 37 santigrat derecede %5 karbondioksit ile farklılaşmasına izin verin. Altıncı günde, her şişeye gerektiği gibi beş mililitre M1 veya M2 polarizasyon ortamı ekleyin. Makrofajların inkübatörde en az iki gün boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede polarize olmasına izin verin.
Sekizinci günde M1 veya M2 makrofajlarını hasat etmeden önce, gerekirse daha fazla kullanım için süpernatanı 15 mililitrelik bir tüpe toplayın. Şişeye bir mililitre hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve inkübe edin. Reaksiyonu durdurmak için, şişeye üç mililitre tam RPMI-1640 Medium ekleyin ve ortamı 15 mililitrelik bir tüpte toplayın.
Şişeye üç mililitre daha ortam ekledikten sonra, hücreleri alttan ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Ayrılan hücreleri 15 mililitrelik yeni bir tüpte toplayın. M1 ve M2 makrofajlarının kalitesini belirlemek için, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve tam RPMI-1640 Ortamında 0.5 kez, tüp başına altı hücrenin gücünde 10 kez yeniden süspanse edin.
Ardından, bir akış sitometrisi tahlili kullanarak iki hücre popülasyonunu analiz edin. Elde edilen M1 ve M2 makrofajlarını bir hemositometre kullanarak tripan mavisi ile bire bir boyama oranında sayın. Makrofajları, RPMI-1640 Tam Ortamda mililitre başına altı hücrenin gücüne 1 çarpı 10'luk bir konsantrasyona yeniden oluşturun.
Bir mikro pipet kullanarak, sekiz kuyucuklu oda sürgüsünün her bir oyuğuna 400 mikrolitre hücre süspansiyonu tohumlayın ve slaytı tamamen nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe en az% 1,5 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. RhD pozitif R2R2 RBC'leri yıkamak için, hücrelere pH 7.4'te PBS ekleyin ve numuneyi beş dakika boyunca 350 G'de santrifüjleyin. Bu tür iki yıkamadan sonra, test RBC örneğini ilgilenilen antikorlarla opsonize edin.
Antikor opsonize edilmiş ve opsonize edilmemiş RBC'leri 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile bir saat boyunca inkübe edin. RBC'lerin yerleşmesini önlemek için her 15 dakikada bir aralıklı olarak girdap yapın. Daha sonra opsonize eritrositleri daha önce gösterildiği gibi pH 7.4'te PBS ile üç kez yıkayın.
RBC opsonizasyonunu kontrol etmek için, birincil opsonize edici antikora ikincil bir opsonize edici anti-insan antikoru ile dolaylı bir antiglobulin testi yapın. Dolaylı antiglobulin testini okuduktan sonra, yıkanmış opsonize RHD artı R2R2 RBC'leri RPMI-1640 Komple Ortam ile hacimce %1.25 hacimce süspansiyon içinde sulandırın. M1 ve M2 makrofajlarının 1.5 saatlik inkübasyonundan sonra, süpernatan ortamı kuyu köşesi boyunca nazikçe aspire edin ve atın.
Ardından, üçlü kurulumun her bir oyuğuna 400 mikrolitre %1.25 opsonize RBC karışımı ekleyin. Numuneyi 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile iki saat boyunca rahatsız edilmeden inkübe edin. Şimdi pH 7.4'te 100 mililitre PBS'yi iki behere dökün.
Sürgüyü ilk behere daldırın ve 20 ila 30 vuruş boyunca yavaşça ileri geri hareket ettirin. Ardından, sürgüyü ikinci behere aktarın ve 20 ila 30 vuruş yıkayın. Slaytı PBS'den çıkarın ve fazla sıvıyı bir kağıt havlu üzerine kurutun.
Hücreleri sabitlemek için slaydı 45 saniye boyunca %100 metanole batırın. Sürgüyü havayla kurutun ve şirket içinde hazırlanmış bir montaj ortamı kullanarak monte edin. Kapak fişi ekleyin ve fagositoz miktarını belirlemeden önce sürgünün gece boyunca kurumasını bekleyin.
M1 ve M2 makrofajları, mikroskopi görüntülerinde gözlenen farklı morfolojik özelliklerle sekiz gün boyunca başarılı bir şekilde polarize edildi ve kültürlendi. Akım sitometrisinde, M1 makrofajları CD80'in yaklaşık% 86.1'ini ve CD209'un% 0.17'sini ekspresyonu gösterdi. M2 makrofajları CD209 ekspresyonunun %97.3'ünü ve CD80 ekspresyonunun %0.003'ünü gösterdi.
Floresan yoğunluğu histogramları, M1 makrofajlarında M2 makrofajlarına kıyasla daha yüksek CD80 ekspresyonunu doğruladı. M2 makrofajları, M1 makrofajlarına kıyasla anlamlı derecede yüksek CD209 ekspresyonu gösterdi. M2 makrofajları, M1 makrofajlarına kıyasla anlamlı derecede yüksek fagositik indeks göstermiştir.
Mikroskopi görüntüleri, M1 makrofajlarına kıyasla M2 makrofajlarında artmış fagositozun açık kanıtlarını gösterdi. Bu çalışma, kırmızı kan hücresi antikor önemini tahmin etmek için monositler yerine makrofajların kullanılma potansiyelini değerlendirmeyi amaçladı. Bu tablo, M2 makrofajlarının fagositozunun M1 makrofajlarından veya klinik olarak anlamlı olduğu düşünülen antikorlara sahip monositlerden daha iyi olduğunu göstermektedir.
Bu nedenle, daha fazla çalışma ile, antikor klinik öneminin daha iyi tahmin edilmesi için M2 makrofajlarını kullanan bir test kullanılabilir.
