Kapsamımız, insan UC-MSC'lerinin spesifik alt gruplarını izole etmek ve temel özelliklerini tek hücreli transkriptomik faktörlerine göre analiz etmektir. Farklı UC-MSC alt popülasyonları için farklı karakterlerin ve işlevlerin hangileri olduğunu cevaplamaya çalışıyoruz. Alanımızdaki en son gelişmeler, çoğunlukla tek hücreli RNA dizilimi kullanılarak karışık MSC popülasyonlarının heterojenliğinin keşfidir.
BAMBI yüksek MFGE8 yüksek hücreleri de dahil olmak üzere insan UC-MSC'leri içindeki üç alt popülasyonu tanımladık. Bu alt grup, lupus nefritinde belirgin bir fenotip, benzersiz transkriptomik profil, sınırlı adipojenik potansiyel ve azalmış immünosüpresif aktivite sergiler. Bu bulgular UC-MSC'lerin anlaşılmasını ilerletir ve belirli hastalıkların tedavisi için en uygun alt grupların seçilmesini destekler.
Sadece BAMBI yüksek MFGE8 yüksek UC-MSC'lerin değil, aynı zamanda diğer iki alt grubun gerçek işlevlerini, özellikle de farklı hastalıkların tedavisindeki rollerini anlamanın yolunu açıyoruz. İnsan UC-MSC alt gruplarının çoklu bağışıklık aracılı hastalıklar üzerindeki uygulamalarına başlamaya ve bu hastalıkların tedavisinde moleküler mekanizmalarını keşfetmeye odaklanmaya devam edeceğiz. BAMBI yüksek MFGE8 yüksek UC-MSC'leri izole etmek için, UC-MSC'yi tam DMEM'de 6 hücrenin gücüne göre yaklaşık 5 ila 10 kat 10 yoğunluğa kadar kültürleyin.
Hücreleri ayırmak için beş dakika boyunca 0.5 milimolar EDTA ekleyin. Ardından, tam DMEM'i ekleyin ve hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Tek Hücreli bir süspansiyon hazırlamak için hücre süspansiyonunu birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
Hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini alın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve toplanan toplam hücre sayısını hesaplayın. Saydıktan sonra, gerekli sayıda hücreyi beş dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin.
Mililitre başına 6 hücre gücüne 5 ila 10 kat 10 katlık bir konsantrasyon elde etmek için peleti bir mililitre tam ortamda yeniden süspanse edin ve tüpü buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, hasat edilen hücreleri dört adet 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne bölün. Primer antikorları 1 ila 100 seyreltmede MFGE8 ve BAMBI tüplerine ekleyin.
İçeriği iyice karıştırın ve hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, etiketli hücreleri yıkamak için PBS ekleyin. Tüpleri 300 G'de beş dakika santrifüjleyin ve peleti bir mililitre tam ortamda yeniden süspanse etmeden önce süpernatanı atın.
Konjuge floresan sekonder antikorları, yeniden süspanse hücrelere 1 ila 1.000 seyreltmede ekleyin. İyice karıştırın ve tüpleri oda sıcaklığında karanlıkta dört 15 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, etiketli hücreleri yıkamak için PBS ve santrifüj ekleyin.
Peleti 500 mikrolitre tam ortamda yeniden süspanse edin ve topakları ve kalıntıları temizlemek için 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden süzün. Akış sitometrisi sıralaması için süzüntüyü 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Boş hücre tüpünü bir antikor eklemeden negatif kontrol olarak çalıştırın.
Lekelenmemiş popülasyon için geçit ölçeğini oluşturmak için akış sitometresindeki ileri saçılma ve yan saçılma ayarlarını yapın. Ardından, pozitifliğin grafikte nerede başladığını belirlemek için tek antikor etiketli MFGE8 ve BAMBI'yi bir geçit kontrolü olarak çalıştırın. BAMBI yüksek MFEG8 yüksek hücre popülasyonunu sıralamak ve sıralanmış hücreleri toplamak için deneysel numune tüplerini çalıştırın.
Sıralanan MSC'leri 24 oyuklu bir plakaya yerleştirin ve hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Sıralanan hücreler iki geçitten geçtikten sonra, sıralanan popülasyonun saflığını doğrulamak için akış sitometrisi analizi yapın. Kültürlenmiş UC-MSC'ler CD44, CD73, CD90 ve CD105 ekspresyonu için güçlü pozitif, CD14, CD34, CD45, CD79 ve HLA DR ekspresyonu için negatifti.
BAMBI yüksek MFEG8 yüksek MSC'leri, ekili insan UC-MSC'lerinden ayrıldı ve yüksek BAMBI ve MFEG8 ekspresyon seviyelerinin üç ila dört geçiş boyunca devam ettiği doğrulandı. BAMBI yüksek MFEG8 yüksek MSC'lerin sıklığı donör ve dissosiyasyon yöntemine göre değişmiştir.
