Biz onların görüntüleme ve mikroskop ekipman kullanımı için Dr Thao&#39;nun Dang ve onun laboratuar üyelerinin ortak çabaları teşekkür ederim. Biz de rahim dokusu ile bize sağlamak için Biorepository ve Doku Araştırma Tesisi (BTRF) çekirdek, Jeff Harper ve Virginia Üniversitesi sakinlerine teşekkür ederim. Biz Şematik Bakış ile yardım için Karol szlachta teşekkür ederim.

Bu yazıda kullanılan histerektomi örnekleri IRB-HSR # 14424 sayılı Üniversite IRB-onaylı etik protokolü ile uyum içinde toplanmıştır. Klinik Kaynak 1. Örnek Edinme <ol><li> Başlamadan önce hükümeti ve kurum-temelli etik kuralları ve onay belgeleri edinmek. </li><li> Steril şartlarda tüm adımları Davranış. </li><li> Numune hemen kültüründe işlenemez 4 ° C de, 50 ml bir tüp içinde ortam (RPMI ya da DMEM / yüksek glukozlu) hasta türetilen dokuları korur. Numuneler, 24 saat bir süre için bu halde saklanabilir. </li><li> 1X steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile bir doku örneği, üç kez yıkanır ve yıkamalar arasında solüsyonu atın. </li></ol> Kazıma Yöntemi kullanılarak Primer Hücre Hatları 2. Hazırlanması <ol><li> Büyüme ortamı (RPMI veya% 10 Fetal Sığır Serumu ve% 1 Penisilin-streptomy ile takviye edilmiş DMEM / Yüksek Glikoz 4-10 ml ekleyincin) dokuya ve 30 dakika boyunca fungizon (0.25 ug / ml nihai konsantrasyon) ekleyin. </li><li> Büyüme ortamı atın. </li><li> 1X PBS ile iki kez doku yıkayın. </li><li> Miyometriyum ve endometriyum katmanları (Şekil daha fazla bilgi için bakınız Şekil 2A-2C) ayırt etmek için 6 cm hücre kültür plakası üzerine doku yerleştirin. Endometrium ayırın. </li><li> 6 cm hücre kültürü çanak üzerine çizilmemesi ise bir neşter veya jilet kullanarak, küçük parçalar halinde doku transect. Bu çizikler çıkan birincil endometrial hücrelerin bağlanmasını kolaylaştırır. Tripsin yöntem ile karşılaştırıldığında, daha fazla doku (bir yaklaşım Şekil 2D bakınız) gereklidir. </li><li> Yavaşça, çizik tabak (doku parçaları görünür ve ideal tırmalama hareketinden hareketsiz olacak) büyüme ortamı 2 ml ekleyin. </li><li> Belirli bir hücre kültürü inkübatöründe için plaka (lar) aktarın (37 ° C ve% 5 CO2). Uzak oth, primer hücre hatları için bir yer tayinHücre kültür tabakları er. Primer kültürler enfeksiyon ve kontaminasyon daha duyarlıdır. </li><li> Günlük ışık mikroskobu altında hücreleri inceleyin. Küçük hücre popülasyonları (Şekil 3B) dilimlenmiş dokuların etrafında güne iki veya üç tarafından ortaya olmalıdır. </li><li> , Kültürleri korumak 1X PBS ile hafifçe yıkayın ve her üç günde bir, taze büyüme ortamı (2 ml) ekleyin. Proliferasyon hızı artar, daha fazla büyüme ortamı (3-4 mi) 6 cm kültür plakasına (lar) ilave edilebilir olduğunda. Not: yıkama ve ortam değişiklikleri sırasında, doku parçaları büyük olasılıkla aspire edilecektir. Bu yapışık hücre büyümesini etkilemez. Yeni koloniler bir hafta sonra ortaya vermemektedirler gibi doku parçaları bir sonraki aşamada (2.10) tarafından aspire edilmelidir. </li><li> % 0.05 tripsin kullanılarak% 80 birleşmiş (Şekil 3B), pasaj - 6 cm plaka yaklaşık 75 olduğunda. Birincil hücreler süresiz pasajlandığında edilemez - iki ya da üç tabak ma kısa sürede hücrelerin bir tabak aşağı dondurmakintained. Daha fazla geçit gerekiyorsa, (Ref 3 gözden) bir ölümsüzleşme protokolünü uygulayın. </li></ol> Tripsin Yöntemi kullanılarak Primer Hücre Hatları 3. Hazırlanması <ol><li> Kanamisin (0.03 mg / ml son konsantrasyon) ile takviye edilmiş% 0.25 tripsin ve 2 ml endometrial doku küçük bir parça (bir yaklaşım Şekil 2D bakınız) yerleştirin. </li><li> 30 dakika süreyle dönen bir platform 37 ° C&#39;de doku inkübe edin. </li><li> Kısaca doku girdap. </li><li> 2 dakika boyunca 200-400 xg&#39;de örnek santrifüj ve süpernatant atın. </li><li> Taze tripsin ve Kanamisini ekleyin. </li><li> Bir saat boyunca dönerken 37 ° C&#39;de doku inkübe edin. </li><li> 5-10 saniye için doku vorteksleyin. </li><li> Tripsin devre dışı bırakmak için (% 10 Fetal Sığır Serumu ve% 1 penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş) 2 ml büyüme ortamı ekleyin. </li><li> 2-3 dakika boyunca 200-400 xg&#39;de Santrifüj hücreleri. </li><li> Süpernatantı atın ve büyümeye 2 ml ekleyintopak hücrelere th ortam. </li><li> 6 cm hücre kültürü çanak üzerine Plate. Kazıma Yöntemi kullanılarak primer hücre hatları hazırlanması Aşama 2.5 ile plaka kazınması gerekli değildir, ancak primer kültürlerin eki ve büyümesini artırır. </li><li> Günlük ışık mikroskobunda hücreyi izleyin. Hücreler (Şekil 3C), 24-48 saat sonra, bir ışık mikroskobu altında genellikle görebilir. </li><li> Kültürleri korumak için, hücreleri izlemek ve Aşama 2.9 &#39;da olduğu gibi her 2-3 günde bir ortam değiştirin. </li><li> Hücreler% 75-80 konfluense (Şekil 3C) ulaştıklarında geçişi için hücreler,% 0.05 ya da% 0.25 tripsin kullanın. </li></ol> 4. Ekstra Analiz Doku (Yapış Dondurma ve Formalin Fixation) Tasarruf <ol><li> 1X PBS ile iki kez numune yıkayın. </li><li> Mümkün olduğu kadar sıvı aspire. </li><li> Yapış Donma için, (Şekil 2F ve 2G bakınız) 1.7 santrifüj tüpüne endometriyal doku örneği yerleştirin. 1,7 yerleştirinSantrifüj tüpü 10 saniye boyunca sıvı azot ya da kadar donmuş doku aşağı olduğu görülmektedir. Not: örnekleri hazırlarken doğrudan sıvı azot dokunmamaya özen gösterin. Numuneler, daha ileri işleme veya analiz edilinceye kadar -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Formalin fiksasyonu için, endometriyal doku (Şekil 2H bakınız) küçük bir parça kesip, ve% 10 tamponlu formalin çinko daldırın. 24 saat sonra, formalin atmak ve tekrar işlenene kadar doku numunelerini,% 70 etanol ekleme. </li></ol> 5. İmmünofloresan (IF) <ol><li> Hücre sabitleme <ol><li> Bir kültür slayt veya tabakta hücreleri hazırlayın. </li><li> Yavaşça, 1X PBS ile hücreleri yıkayın. </li><li> 5 dakika boyunca (bir 1:1 oranında karıştırılmış) önceden soğutulmuş (4 ° C) bir metanol ve aseton ekleyin. </li><li> Hava geçmeden önce slayt kurulayın. Gerekirse Slide 1-2 hafta boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol></li><li> İşlem IF <ol><li> 10 dakika boyunca 1X PBS ile hücreler rehidrate. FO içinllowing dönen bir platform üzerinde tüm yıkar ve inkubasyon yapmak, 1-6 adımları. </li><li> 1X PBS kullanılarak blok,% 1 Sığır Serum Albümini (BSA) ile takviye edilmiş ve oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca% 1 türe özel serum (2. antikor kaynağı). </li><li> (Antikor dilüsyonları için üreticilerin tavsiyelerine bakın) primer antikor inkübe. Özel antikorlar için malzemeler bakınız. Aşama 5.2.2 &#39;de olduğu gibi, taze bloke edici tampon birincil antikor seyreltin. Bu inkübasyon, oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C&#39;de en az 2 saat boyunca yapılabilir </li><li> 5 dakika her biri için 1X PBS ile 3 kez yıka. </li><li> (Antikor dilüsyonları için üreticilerin tavsiyelerine bakın) ikincil antikor inkübe edin. Adım 5.2.2 gibi taze engelleme tamponda ikincil antikor sulandırmak. Foto-ağartma önlemek için, ışık yokluğunda bu ve daha sonraki adımlar yapmak için önemlidir. </li><li> 5 dakika her biri için 1X PBS ile 3 kez yıka. </li><li> Thoroughly slaytlar kurulayın. </li><li> Montaj ortamı ve DAPI karşı boyama solüsyonu ekleyin. </li><li> Lamel uygulayın ve yapıştırıcı (ler) kullanarak kenarları mühür. Slaytlar kadar 2 hafta boyunca karanlıkta 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol></li></ol> 6.. RNA Ekstraksiyon <ol><li> Santrifüj ile x 1 10 7 hücrelerinin Pelet. Bu protokol tüm malzemeler ve reaktifler ücretsiz RNAz edilmelidir. </li><li> 1 ml Trizol reaktifi ve nükleoprotein kompleksleri ayrılmasını tamamlamak için oda sıcaklığında 10 dakika boyunca homojenize örnekleri inkübe olarak Hücreleri,. </li><li> Trizol 1 ml kloroform başına 200 ul ekle. 15 saniye boyunca elle kuvvetli bir şekilde çalkalanır ve oda sıcaklığında 2-3 dakika inkübe edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika süreyle maksimum hızda (15,000 xg) santrifüje Üç katmanları neden olacaktır. </li><li> Yeni bir mikrosantrifüj tüpü içine üst sulu faz transfer. RNA verimi artırmak için 1 ul glikojen ekleyin; Ancak bu adım sadece gerekli olduğunda, küçük birRNA miktarı tahmin edilmektedir. </li><li> Sulu tabakaya, izopropil alkol, 0.5 ml ilave edilir, ve örnekler 3-5 kez ters çevirin. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Verimini artırmak için, numuneler, 30 dakika boyunca -20 ° C veya -80 ° C de yerleştirilebilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika maksimum hızda santrifüje </li><li> Bu noktada, RNA küçük topak görünür olmalıdır. Süpernatant atın. </li><li> % 75 etanol içinde 1 ml RNA yıkayın. </li><li> 5 dakika boyunca maksimum hızda santrifüj ve süpernatant atın. Numuneler, bir kez inorganik kirletici maddeleri kurtulmak için daha yıkanabilir, fakat bu adım gerekli değildir. </li><li> RNA pelet kuru kadar kısa bir süre (genellikle 7-10 dakika sürer) RNA pelet kurulayın. Not: Bir ek adım inorganik maddeler azalır ve kurutma süresini azaltmak için kullanılabilir. Ek bir dakika ve aspirat kalıntı sıvı için maksimum hızda etanol yıkaması, spin örneklerinden süpernatant atılmasından sonra. Pelet aspire etmemeye dikkat edin. </li><li> RNA pelet boyutuna bağlı olarak, RNase-içermeyen su içinde RNA çözülür. Hacimleri 10-50 ul arasında değişir. </li><li> 10 dakika boyunca 55 ° C&#39;de inkübe edin ve RNA konsantrasyonları ölçülür. </li><li> Daha sonra işlenene kadar -20 ° C&#39;de saklayın örnekleri. </li></ol> 7. Ters Transkripsiyon <ol><li> H2O ile 9 ul bir hacme örnek RNA (1-3 ug) getirin </li><li> 10 dakika boyunca 70 ° C&#39;ye kadar ısı RNA. </li><li> DNTP 5 ul (50 uM çalışma konsantrasyonu), N6 DNA oligo 5 ul (80 uM çalışma konsantrasyonu), 5X AMV tampon çözeltiden 5 ul ve AMV 1 ul: Bir AMV ana karışımı oluşturmak için, aşağıdaki reaktifler kombine . Bu ana karışımı çözelti bir numune başına tasarlanmıştır. </li><li> Isıtmalı RNA&#39;ya ana karışımı 16 ul ekleyin. Nihai reaksiyon hacmi 25 ul reaksiyon olacaktır. </li><li> (Aşama 1), 90 dakika boyunca 42 ° C, (Sta: ters transkripsiyon için, aşağıdaki koşulları kullanarak PCR5 dakika ve daha sonra işlenene kadar (Aşama 3), 4 ° C ge 2) 95 ° C. </li></ol> 8. Real Time PCR <ol><li> Tablo 1 &#39;de bulunan primerler, tavlama sıcaklıkları, devir sayıları ve reaktif maddeler kullanılarak PCR reaksiyonları yürütmek için. Not: (Malzeme şirket ve katalog numaraları bakınız) PCR bileşenlerini kullanırken üretici talimatları takip etmek için idealdir. </li></ol> 9. (Ref. 4 ve 5&#39;te elde edilir) In vitro desidualizasyon Protokol <ol><li> Endometrial hücreler Plate. </li><li> % 75-85 bir konfluansa kadar büyür. </li><li> Hücreler konfluent hale sonra, 1X bir kez PBS ile yıkayın. </li><li> Çabuk, (Fenol RPMI% 5 kömür şerit FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş) hormonsuz ortam ekleyin. </li><li> 24 saat sonra, 1 uM 8-3 Bromoadenosine bir son konsantrasyonda medroksiprogesteron asetat (MPA) ile desteklenmiş Hormonsuz ortam &#39;, 5&#39; ekleme0.5 mM&#39;lik bir son konsantrasyonda-siklik monofosfat (cAMP). </li><li> En az 48 saat sonra, reaksiyonu durdurmak ve daha ileri işleme için plaka (lar) kaydedin. </li></ol>

<ol>
	<li>Heller, D., Heller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> in The endometrium: a clinicopathologic approach. , 56-75 (1994).</li><li>Emera, D., Romero, R., Wagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+menstruation:+a+new+model+for+genetic+assimilation:+explaining+molecular+origins+of+maternal+responses+to+fetal+invasiveness.">The evolution of menstruation: a new model for genetic assimilation: explaining molecular origins of maternal responses to fetal invasiveness.</a> Bioessays. 34, 26-35 (2011).</li><li>Gudjonsson, T., Villadsen, R., Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+protocols+used+in+cell+culture+models+of+human+breast+morphogenesis.">Immortalization protocols used in cell culture models of human breast morphogenesis.</a> Cell Mol Life Sci. 61, 2523-2534 (2004).</li><li>Brosens, J. J., Hayashi, N., White, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+receptor+regulates+decidual+prolactin+expression+in+differentiating+human+endometrial+stromal+cells.">Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells.</a> Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).</li><li>Jones, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+SUMO+pathway+sensitizes+differentiating+human+endometrial+stromal+cells+to+progesterone.">Regulation of the SUMO pathway sensitizes differentiating human endometrial stromal cells to progesterone.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 16272-16277 (2006).</li><li>Salamonsen, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+the+human+endometrium+and+uterine+fluid:+a+pathway+to+biomarker+discovery.">Proteomics of the human endometrium and uterine fluid: a pathway to biomarker discovery.</a> Fertil Steril. 99, 1086-1092 (2013).</li><li>Haouzi, D., Dechaud, H., Assou, S., De Vos, J., Hamamah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+human+endometrial+receptivity+from+transcriptomic+and+proteomic+data.">Insights into human endometrial receptivity from transcriptomic and proteomic data.</a> Reprod Biomed Online. 24, 23-34 (2012).</li><li>Chen, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+midproliferative+and+midsecretory+human+endometrium.">Proteomic characterization of midproliferative and midsecretory human endometrium.</a> J Proteome Res. 8, 2032-2044 (2009).</li><li>Talbi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phenotyping+of+human+endometrium+distinguishes+menstrual+cycle+phases+and+underlying+biological+processes+in+normo-ovulatory+women.">Molecular phenotyping of human endometrium distinguishes menstrual cycle phases and underlying biological processes in normo-ovulatory women.</a> Endocrinology. 147, 1097-1121 (2006).</li><li>Punyadeera, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oestrogen-modulated+gene+expression+in+the+human+endometrium.">Oestrogen-modulated gene expression in the human endometrium.</a> Cell Mol Life Sci. 62, 239-250 (2005).</li><li>Ponnampalam, A. P., Weston, G. C., Susil, B., Rogers, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+human+endometrium+during+the+menstrual+cycle.">Molecular profiling of human endometrium during the menstrual cycle.</a> Aust N Z J Obstet Gynaecol. 46, 154-158 (2006).</li><li>Zhang, L., Rees, M. C., Bicknell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+long-term+culture+of+normal+human+endometrial+epithelium+and+stroma.+Expression+of+mRNAs+for+angiogenic+polypeptides+basally+and+on+oestrogen+and+progesterone+challenges.">The isolation and long-term culture of normal human endometrial epithelium and stroma. Expression of mRNAs for angiogenic polypeptides basally and on oestrogen and progesterone challenges.</a> J Cell Sci. 108 (1), 323-331 (1995).</li><li>Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+cells+from+term+human+decidua+closely+resemble+endometrial+stromal+cells:+induction+of+prolactin+and+insulin-like+growth+factor+binding+protein-1+expression).">Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression).</a> Biol Reprod. 52, 609-615 (1995).</li><li>Gellersen, B., Brosens, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP+and+progesterone+receptor+cross-talk+in+human+endometrium:+a+decidualizing+affair.">Cyclic AMP and progesterone receptor cross-talk in human endometrium: a decidualizing affair.</a> J Endocrinol. 178, 357-372 (2003).</li><li>Marsh, M. M., Hampton, A. L., Riley, S. C., Findlay, J. K., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+characterization+of+endothelin+released+by+human+endometrial+epithelial+cells+in+culture.">Production and characterization of endothelin released by human endometrial epithelial cells in culture.</a> J Clin Endocrinol Metab. 79, 1625-1631 (1994).</li><li>Siegfried, J. M., Nelson, K. G., Martin, J. L., Kaufman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+identification+of+cultured+cells+from+human+endometrium.">Histochemical identification of cultured cells from human endometrium.</a> In Vitro. 20, 25-32 (1984).</li><li>Rawdanowicz, T. J., Hampton, A. L., Nagase, H., Woolley, D. E., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+production+by+cultured+human+endometrial+stromal+cells:+identification+of+interstitial+collagenase,+gelatinase-A,+gelatinase-B,+and+stromelysin-1+and+their+differential+regulation+by+interleukin-1+alpha+and+tumor+necrosis+factor-alpha.">Matrix metalloproteinase production by cultured human endometrial stromal cells: identification of interstitial collagenase, gelatinase-A, gelatinase-B, and stromelysin-1 and their differential regulation by interleukin-1 alpha and tumor necrosis factor-alpha.</a> J Clin Endocrinol Metab. 79, 530-536 (1994).</li><li>Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+11+advances+progesterone-induced+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells.">Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells.</a> Mol Hum Reprod. 8, 636-643 (2002).</li><li>Sakai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+histone+acetylation+in+ovarian+steroid-induced+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells.">Involvement of histone acetylation in ovarian steroid-induced decidualization of human endometrial stromal cells.</a> J Biol Chem. 278, 16675-16682 (2003).</li><li>Logan, P. C., Ponnampalam, A. P., Steiner, M., Mitchell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cyclic+AMP+and+estrogen/progesterone+on+the+transcription+of+DNA+methyltransferases+during+the+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells.">Effect of cyclic AMP and estrogen/progesterone on the transcription of DNA methyltransferases during the decidualization of human endometrial stromal cells.</a> Mol Hum Reprod. 19, 302-312 (2013).</li><li>Tamura, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+IGFBP-1+expression+by+cAMP+is+associated+with+histone+acetylation+status+of+the+promoter+region+in+human+endometrial+stromal+cells.">Induction of IGFBP-1 expression by cAMP is associated with histone acetylation status of the promoter region in human endometrial stromal cells.</a> Endocrinology. 153, 5612-5621 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> American Society for Reproductive Medicine: Quick facts about infertility. , (2013).</li><li>Salker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+selection+of+human+embryos:+impaired+decidualization+of+endometrium+disables+embryo-maternal+interactions+and+causes+recurrent+pregnancy+loss.">Natural selection of human embryos: impaired decidualization of endometrium disables embryo-maternal interactions and causes recurrent pregnancy loss.</a> PLoS One. 5, (2010).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Diğer gruplar kolajenaz 4,12,13,15-18 kullanan çoğu endometriyal stromal kültürleri, hazırlanması için bir yöntem tarif adapte edilmiştir. Bu yazıda, ekonomik nedenler ve tripsin ve / veya jilet uygun kullanılabilirliği için bizim laboratuvarda tarafından kullanılan her ikisi de iki basitleştirilmiş temel endometrial stromal kültür yöntemleri için metodoloji ve kanıt sağladı. Bizim iki yöntem kıyaslarken, hem başarıyla uygulanabilir birincil kültürleri üretmek. Daha küçük bir numune boyutu şartı ile, tipik olarak yüksek bir verim saptandığı gibi tercih edilen bir yöntem olup, tripsin yöntemdir. Hazırlık süresi sınırlı ise tripsin yöntemini kullanarak hücreleri kaplama bir saat bir buçuk daha alır oysa Ancak, kazıma yöntemi 30 dakika gerektirir. Dikkat çekici endometrial biyopsi karşıt olarak biz histerektomi örnekler bu yöntemleri göstermek olmasıdır. Endometrial biopsies önemli saldırı olmadan alınan ve daha küçük örnekleri üretmek için eğilimindedir. Yine de, bu yazının (özellikle tripsin yöntemi) &#39;de tarif edilen yöntemler, endometrial biyopsi ikinci kültürleri verim gerekir. Birincil endometrial stromal hücreler için çok sayıda uygulama vardır. Diğer memeliler karşı insan endometriyal stromal kültürlerini karşılaştıran insanlar regl neden hakkında yüzyıllardır tartışılan edilmiştir sorulara ipuçları sağlayabilir. In vitro kültür gerektiren diğer keşfedilmemiş fizyolojisi çalışmalar vardır. Özel ilgi gibi üreme döngüsü 19,20, 21 fonksiyonel olaylara epigenetik moleküler olayları bağlantılı ve Ref 11 inceledik bulguları olarak üreme döngüsü olaylar içgörü sağlamak keşifler. Klinisyenler endometrial stromal kültür, eğitim ve biyogöstergesini belirlenmesi büyük ölçüde yararlanacaküreme bozuklukları ve kanser malignitelerin durumlarda s. 2006 ve 2010 yılları arasında, bu 7,4 milyon kadın ve eşleri Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde 22 kısırlık hizmetlerini kullandıkları bildirildi. Kısırlığın önemli bir yüzde desidualizasyon 23 yetmezliği kaynaklanmaktadır. Ayrıca, bu tür kısırlığa hiperplazi ve endometrioz gibi endometrial hastalıklar arasındaki ilişki yakın zamanda değerlendirilmektedir. Gelişmiş endometrial sarkom nadir bile olsa, bu ölümcül olabilir çünkü in vitro modelleme yoluyla rahim jinekolojik kanserlerin çalışma kapasitesi de ölçülemez. Vitro primer kültürlerinde kurarak, biz hastalıkları ile ilişkili moleküler olayların etkisini incelemek ve farazi klinik uygulamaları oluşturabilirsiniz. Sonuç olarak, bu uygulamaların çoğu için temsili ve in vivo modellerde etkili üretilmesi zordur. Bu, içinde geliştirme yaparçeşitli in vivo işlevler kritik incelemek için birincil endometrial kültürleri vitro. Bu iki endometrial izolasyon yöntemleri, &quot;kazıma yöntemi&quot; ve &quot;tripsin yöntemi,&quot; endometrial fizyolojisi ve patolojisi anlayışımız için dayanak sağlamaya yardımcı olacaktır.

Insan uterus gövdesi üç tabakadan, perimetrium (ya da salgılı zarı), myometrium ve endometrium oluşur. Bu tabakaların her biri ayırt endometrial hücre serilerini kurmak için önemli bir adımdır. Perimetrium rahim en dış tabaka ve ince, seröz hücrelerden oluşur. Myometrium kalın, orta rahim tabakası ve yumuşak kas hücrelerinin oluşur. Endometrium rahim iç tabaka olarak tanımlanmıştır ve epitel ve stromal hücre popülasyonları içerir. Endometrium ayrıca olan kök hücre popülasyonunun yaklaşık olarak her 28 günde bir 1 functionalis tabaka yeniden doldurmak için hipotezi basalis tabaka halinde bölünmüştür. İnsan endometrium tabakası functionalis hormonları dolaşan yanıt önemli biyokimyasal ve morfolojik değişikliklere uğrar. Bu hormonlar hipofiz bezi ve yumurtalıklar türetilir. bir üreme döngüsü koordine üretim ve hormonlar sonuçların serbest. Üreme döngüsü potansiyel embriyo implantasyon olaylar için endometrium hazırlamak için tasarlanmıştır. İnsanlarda, üreme döngüsü &quot;adet döngüsü&quot; olarak bilinen ve üç evreye ayrılır - çoğalma, salgı ve adet. Salgı faz functionalis olgunlaşması ile işaretlenmiş ise çoğalma fazı functionalis endometrial tabakanın proliferasyonunu içerir. Spesifik olarak, hücre dışı değişiklikler, salgılar ve hücresel farklılaşma potansiyel implantasyonu işaret etmektedir. Implantasyon salgı aşamasının bitiminden önce oluşmazsa, functionalis endometrium tabakası adet aşamasında dökülüyor. Âdet ve functionalis tabakasının dökülmesini tetikleyen olayların önemi hala tartışılmaktadır. İnsanlarda, bu adet bilinen özel bir orta salgı faz farklılaşması olayın sonucu olduğunu ortaya edilmiştir&quot;spontane sidualizasyonu&quot; 2 olarak. Bu yazıda, iki endometrial stromal hücre izolasyon yöntemleri için detaylı metodoloji sağlamak ve bu yaklaşımların etkinliğini göstermek için immünofloresans ve dijital görüntülerin bir arada kullanın. Ayrıca, yaygın olarak uygulanır endometriyal stromal hücre izolasyonu teyit etmek için kendiliğinden desidualizasyon in vitro modelde kullanılan a.

<table><tbody><tr><td>0.25 Trypsin or 0.05% Trypsin&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH3023602 or SH30004202</td><td></td></tr><tr><td>1.7 micro Centrifuge Tube&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-272A</td><td></td></tr><tr><td>1 &amp;micro;l, 20 &amp;micro;l, 200 ml and 1,000 &amp;micro;l Pipette&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-401,24-402, 24-412, 24-430</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Conical Tube&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical Tube&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>6 cm Cell Culture Dish&amp;nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>12-556-002</td><td></td></tr><tr><td>8 well Chambers&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-4162</td><td></td></tr><tr><td>Acetate&amp;nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>C4-100</td><td></td></tr><tr><td>AMV RT Enzyme/Buffer&amp;nbsp;</td><td>Bio Labs</td><td>M077L</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1605-100</td><td></td></tr><tr><td>Buffered Zinc Formalin&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td>59201ZF</td><td></td></tr><tr><td>Charcoal strip FBS&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>NC9019735</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip&amp;nbsp;</td><td>Fisher Brand</td><td>12-544D</td><td></td></tr><tr><td>Cyclic AMP (cAMP)&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B7880</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/High Glucose&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30243FS</td><td></td></tr><tr><td>dNTP&amp;nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti Goat -TRITC&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-3855</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Serum&amp;nbsp;</td><td>Jackson&amp;rsquo;s lab</td><td>017-000-002</td><td></td></tr><tr><td>E Cadherin Antibody&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Epitomics</td><td>1702-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-1</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-600-511</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone Amphotericin B&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH Probe&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>HS99999905</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen&amp;nbsp;</td><td>5Prime</td><td>2301440</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti Mouse - FITC&amp;nbsp;</td><td>Jackson&amp;rsquo;s Lab</td><td>115-096-003</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Medroxyprogesterone acetate (MPA)&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M1629</td><td></td></tr><tr><td>MeOH (Methanol)&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4-08-1</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Media (w/DAPI)&amp;nbsp;</td><td>Vector Labratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>N6 DNA Oligos&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Number 15 Scraper&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>371615</td><td></td></tr><tr><td>Pan Cytokeratin&amp;nbsp; Mouse mAB&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>4545</td><td></td></tr><tr><td>PBS (phosphate buffered saline)&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-399-4</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Glutamine Solution 100X&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SV30082.01</td><td></td></tr><tr><td>PML Anti Goat Anti body&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9862</td><td></td></tr><tr><td>Primer(s)&amp;nbsp;</td><td>Eurofins</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30027FS</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (Phenol free)&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11835</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Green&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-4162</td><td></td></tr><tr><td>Taqman&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td>AB-4138</td><td></td></tr><tr><td>Trizol&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin Antibody&amp;nbsp;</td><td>Epitomics</td><td>4211-1</td><td></td></tr></tbody></table>

two methods for establishing primary human endometrial stromal cells from hysterectomy specimens

Pek çok çabalar vitro hücre kültür sistemleri kurmak için tahsis edilmiştir. Bu sistemler, in vivo işlemler geniş bir model numarası tasarlanmıştır. İnsan endometriyal örnekleri kaynaklanan hücre kültürü sistemleri bir istisna vardır. Uygulamalar normal siklik fizyolojik süreçler böyle jinekolojik kanserler, bulaşıcı hastalıklar ve üreme eksiklikleri gibi endometrial patolojilerin değişir. Burada, biz, cerrahi rezeksiyon, endometrial histerektomi örneklerden birincil endometrial stromal hücreler kurmak için iki yöntem sağlar. İlk yöntem, &quot;kazıma yöntemi&quot; olarak adlandırılır ve ikinci yöntem adlandırılır ise, cerrahi ya da tıraş bıçakları kullanılarak, mekanik kazıma içeren bir &quot;tripsin yöntemi.&quot; Bu ikinci yöntem, hücrelerin ayrılmasını teşvik etmek için birincil ve tripsin enzimatik aktivitesini kullanır hücre akıbet. Biz dijital görüntü ve mikroskobu ile adım-adım yöntemi açıklamak. Ayrıca providkantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonları (qPCR) ve immünfloresansta (IF) üzerinden endometrial stromal hücre hatları doğrulamak için e örnekleri.

Protokol bölümünde vurgulandığı gibi, insan doku kullanımı ve hazırlarken tüm kurumsal hükümet altında yöntemleri ve etik kurallara yapmak için emin olun. &quot;Kazıma yöntemi&quot; genel iş akışı bir örnek (Şekil 1A) ve primer endometrial kültürleri kurmak için kullanılan &quot;tripsin metodu&quot; (Şekil 1B) bu yazının da dahildir. Bu yöntemler Protokol bölümünde ayrıntılı olarak tarif edilmiştir (parça 1 e bakınız -. 3..). Her iki yöntem de, birincil endometrial kültürlerin büyümesinin başarılı kanıtlamaktadır. Avantaj &quot;kazıma yöntemi&quot; kısaltılmış hazırlık zamanı için; göre 4 kat daha uzun - ancak, bu canlı hücreleri gözlemlemek için gereken zamanı 2 genellikle &quot;tripsin yöntemi.&quot; Doku tedarik alınan ilk insan dokusunda dijital görüntüler sağladı. Rahim tabakaları ile ayırt edilebilirTabakanın irilik, myometrium yani kalın ve kas ve endometrium ince ve daha verimli olduğunu. Biz beyaz kalın, düz kas tabakası (myometrium) vurgulanmış ve iki farklı histerektomi numuneler (Şekil 2A ve 2B) siyah ilgi endometrium tabakası hatlarıyla. Şekil 2C, dokular endometrium aşağı konumlandırılmış iken miyometriyum yukarı bakacak şekilde yönlendirilmiştir. İnce, perimetrial tabaka cerrahi rezeksiyon ve bu görüntüleri vurgulanan değildi. Bu dijital 2 boyutlu görüntüler endometrial tabakanın boyutu gerçek 3 boyutlu tabaka myometrium kıyasla çok ince olduğu gibi yanlış olduğuna dikkat etmek de önemlidir. Uygun doku boyutunu Kesme &quot;kazıma yöntemi&quot; ve her ikisi için önemli olan &quot;tripsin yöntemi.&quot; Şekil 2B, uygun boyutlarda ayrı ayrı numunenin üstüne, her yöntem için belirlenir. Bir 0.5x0 kullanma&quot;Tripsin yöntemi&quot; [left] .5 x0.5 cm parça kültürünün yerleşmesi için yeterlidir. &quot;Kazıma yöntemi&quot; [sağ] için temsili başlangıç ​​dokusu tüm rahim katmanları içerir. &quot;Kazıma yöntemi&quot; için nihai ürün, Şekil 2E&#39;de temsil edilir, ve endometriyal dokunun en az 1x1x1 cm uygun bir kültürleri oluşturmak için kullanılması önerilir. Bu çok doku numunesi için gereksinim bir dezavantaj &quot;kazıma yöntemi.&quot; Kalan doku çoğunlukla proteini içeren ve RNA analizleri çeşitli şekillerde kullanılmaktadır. Doku kalitesinin korunmasını sağlamak için, (4&#39;e bakın.) Protokol bölümünde olduğu gibi bir &quot;ani dondurularak&quot; yöntemini kullanmak önemlidir. Bu yöntem aynı zamanda Şekil 2F ve 2G Şekil &#39;de gösterilmiştir. Formalin fiksasyonu ekstra doku tasarrufu da patologlar ve araştırmacıların yaygın bir uygulamadır. Formalin fiksasyonu için hazırlanıyor doku Protokolü anlatılan </stRong&gt; bölüm (. 4) ve Şekil 2H&#39;de resimli. Işık mikroskopisi birincil endometrial kültürleri izlenmesi için gereklidir. Bağımsız endometriyal stromal fibroblast hücrelerin morfolojisi (Şekil 3A) göstermelidir. &quot;Kazıma yöntemi&quot;, tipik olarak esas olarak bisturi kaynaklı çizik (Şekil 3B, Gün 2) boyunca, erken ortaya çıkan hücre kümeleri oluşturur. &quot;Tripsin yöntemi&quot; küme ve dağınık hücre büyüme modelleri (Şekil 3C, Gün 4) hem de üretir. Her yöntemiyle (Şekil 3B ve 3C) ilk geçişi için ilk kaplama (gün 0) itibaren bir kaç temsili görüntü dahil ettik. Geni ve protein ekspresyon deneyleri endometriyum 6-11, en-için yapılmıştır da birçok dokular vs bağışıklık kök hücreleri, düz kas, CD34 için düz kas aktin (SMA), gibi dokuya özel belirteçler onların ifadesi ile tanımlanmaktadırdometrial stromal hücre özel markör henüz tespit edilmesi gerekir. Bunun yerine, araştırmacılar genellikle potansiyel hücre kirliliklerden belirteçleri ölçülerek endometrial stroma saflığı değerlendirmek. Örneğin, sitokeratin belirteçler epitel popülasyonları göstermek için kullanılır. Kurulması ve endometrial epitelyum zor ve genelde (Ref 12 ve Şekil 4A), karşı seçilir muhafaza Ancak, bu, bir endişe daha azdır. Numuneler hamilelik, HLA-A pozitif ekspresyonu sırasında elde edilecek olursa,-B,-C germ, trofoblast hücrelerin 13 göstermektedir. Öte yandan, diğer mezenşimal fibroblastlar gibi, endometriyal stromal hücreleri vimentin (CDH1) ifade eder. Biz immünofloresans, vimentin ifadesi ve bizim kurulan endometrial stromal hücreleri (Şekil 4B) sitokeratin ve E kadherin (CDH1) yokluğu ile göstermek. Son olarak, bir i ile birincil endometrial kültür fonksiyonel kanıtn spontan sidualizasyonu deneyi vitro. Bu yöntem, Referans 4 ve 5 uyarlanmıştır ve medroksiprogesteron asetat (MPA) ve 8 bir kombinasyonu ile kültürlerin muamele edilmesini içerir edilmiş - Bromoadenosine 3 &#39;, 5&#39;-siklik monofosfat 9&#39;da tarif edildiği gibi (cAMP) (In vitro desidualizasyon protokol ve model. Şekil 5A). MPA ve cAMP varlığında, endometriyal stromal hücreler (Ref 14 gözden) önemli ölçüde değiştirilmiş gen ekspresyon profillerini gösterir. Sık sık yayınlanan spontan sidualizasyonu belirteçleri prolaktin (PRL) ve Protein 1 (IGFBP1) Cilt İnsülin benzeri Büyüme Faktörü (Ref 14 gözden). MPA ve cAMP için bu iki genin yanıt kendiliğinden desidualizasyon ve endometriyal stromal kültürünün başarılı kurulması hem de güçlü bir göstergesidir. Biz, Şekil 5B&#39;de bu göstermektedir. Şekil 1. İki birincil endometrial izolasyon yöntemleri şematik. (A) (B). Bir organizasyon şemasında gösterilen kazıma yöntemi 2,1-2,10 adımları bir organizasyon şemasında gösterilen tripsin yöntemi 3,1-3,14 adımları. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51513/51513fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 2," fo:content-width="2.75in" src="/files/ftp_upload/51513/51513fig2highres.jpg" width="500" /> Şekil 2.. Rahim dokusu işleniyor. Iki kadın hastaların (AC) Clinical rahim örnekleri. Hasta A &amp; C 1 &#39;den türetilen ve oda Hasta 2 elde edilir. Cerrahi olarak kesilmiş rahim dokusu (sol) ve highlighted rahim katmanları (sağda). (A &amp; B) miyometriyum siyah beyaz ve endometrium daire içinde. (C) miyometriyum kamera karşı karşıya. (D) hem de izolasyon yöntemleri için ilk temsili endometrial örnek boyutları gösterilir. Kazıma yöntemi, tüm rahim örnekleri de kullanır ise tripsin yöntem olup, tripsin ilave edilmeden önce saf endometrium gerektirir. Kazıma yöntemin işleme endometrial numunesinin (E) Örnek. (F ve G) Snap hazırlanan kalan rahim dokusu görüntü Dondurucu. Gösterilen bu yöntem için kullanılan bir laboratuvar yapımı metal kaptır. (H) endometriyal numune formalin fiksasyonu. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51513/51513fig2highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 3," fo:content-width="3in" src=&quot;/ Files/ftp_upload/51513/51513fig3highres.jpg&quot; width = &quot;400&quot; /&gt; Şekil 3.. Primer endometrial kültürlerin Işık mikroskobu görüntüleri. . (A) çeşitli güçlerde ve confluency alınan endometrial stromal hücre kültürlerinin Temsilcisi görüntüleri (B) kazıma yöntemi (Gün 0 - 16) Temsilcisi görüntüleri 10x güç aynı kültür çanak, alınan Not:. Görsel çizgiler çizikleri gösteriyor cerrahi bıçak tripsin yöntemi (C) Temsilcisi görüntüler.. (Gün 0 - 16) 10x güç aynı kültür çanak, alınan <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51513/51513fig3highres.jpg" target="_blank">büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 4," fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51513/51513fig4highres.jpg" width="400" /> Şekil 4. Endometriyal stromal hücrelerin İmmünofloresan görüntüler. (A) İmmünofloresanbirincil endometrial kültürlerin kazıma yöntemi ile izole edilmiştir. Görüntü kanalı 2 (P2) ve geçiş 5 (P5) arasında sitokeratin kaybını göstermektedir. Promiyelositik lösemi protein (PML), nükleer protein ve DAPI boyama kontrol olarak kullanılmıştır. (B) Görüntüler, mezenkimal işaretleyici Vimentin için pozitif lekeleme göstermiştir. Görüntüler ayrıca E kadherin (CDH1) ve Sitokeratin için negatif boyanma gösterir. DAPI ve Promiyelositik lösemi protein (PML) için boyama kontrol olarak verilmiştir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51513/51513fig4highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51513/51513fig5highres.jpg" width="500" /> Şekil 5. Başlıca iki endometrial stromal hücrelerin spontan sidualizasyonu. Deneysel işlemin (A) hatlarıdır. (B) Prolaktin upregülasyonu (PRL) veMPA ve cAMP tepki olarak protein 1 (IGFBP1) gen ekspresyon Bağlama İnsülin benzeri büyüme faktörü. Sonuçlar RT-QPCR ile ölçüldü, ve ifade GAPDH normalize edildi. Önemi öğrenciler t-testi (p &lt;0.001 *** ve P &lt;0.0001 ****) kullanılarak hesaplanmıştır. Her iki hücre çizgileri kazıma yöntemi kullanılarak izole edilmiştir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51513/51513fig5highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Astar boya </td><td> Sekans </td><td> Tavlama Sıcaklığı (° C) </td><td> Döngüleri </td><td> Tahlil </td></tr><tr><td> Prolaktin (PRL) Forward </td><td> CATATTGCGATCCTGGAATGAGC </td><td> 60 </td><td> 40 </td><td> SYBR @ Green </td></tr><tr><td> Prolaktin (PRL) Ters </td><td> TCCTCAATCTCTACAGCTTTGGA </td><td> 60 </td><td> 40 </td><td> SYBR @ Green </td></tr><tr><td> İnsülin benzeri büyüme faktörü bağlayıcı protein 1 (IGFBP1)Ileri </td><td> TCCTTTGGGACGCCATCAGTAC </td><td> 60 </td><td> 40 </td><td> SYBR @ Green </td></tr><tr><td> İnsülin benzeri büyüme faktörü bağlayıcı protein 1 (IGFBP1) Ters </td><td> GATGTCTCCTGTGCCTTGGCTA </td><td> 60 </td><td> 40 </td><td> SYBR @ Green </td></tr><tr><td> GAPDH </td><td> Tanımlanmamış (reaktif listesine bakınız) </td><td> 60 </td><td> 40 </td><td> Taqman </td></tr></tbody></table> Sidualizasyonu belirteçleri Tablo 1. PCR koşulları.

Watch this Scientific Journal Video about Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens at JoVE.com

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

Histerektomi örneklerden primer endometrial stromal hücre kültürü sistemlerinin kurulması, önceki araştırma amaçlayan geniş bir dizi takip için değerli bir biyolojik teknik ve çok önemli bir adımdır. Burada, insan hasta cerrahi olarak kesilmiş dokuları endometriyal stromal kültürleri oluşturmak için kullanılan iki yöntem tarif eder.

Histerektomi Örneklerden İlköğretim İnsan endometrial stroma hücrelerinde Kurulması İçin İki Yöntem

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

two-methods-for-establishing-primary-human-endometrial-stromal-cells

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

22.7K Görüntüleme.  University of Virginia.  Histerektomi örneklerden primer endometrial stromal hücre kültürü sistemlerinin kurulması, önceki araştırma amaçlayan geniş bir dizi takip için değerli bir biyolojik teknik ve çok önemli bir adımdır. Burada, insan hasta cerrahi olarak kesilmiş dokuları endometriyal stromal kültürleri oluşturmak için kullanılan iki yöntem tarif eder. 

Video: Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

Fare Endometrial stromal ve epitelyal hücrelerin izolasyonu için<em&gt; İn Vitro</em&gt; sidualizasyonu

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Gelişim Biyolojisi

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and recurrent disease. This population can be identified by surface markers, enzymatic activity and a functional profile. These approaches per se are limited, due to phenotypic heterogeneity and CSC plasticity. Here, we update the sphere-forming protocol to obtain CSC spheres from breast and gynecological cancers, assessing functional properties, CSC markers and protein expression. The spheres are obtained with single-cell seeding at low density in suspension culture, using a semi-solid methylcellulose medium to avoid migration and aggregates. This profitable protocol can be used in cancer cell lines but also in primary tumors. The tridimensional non-adherent suspension culture thought to mimic the tumor microenvironment, particularly the CSC-niche, is supplemented with epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor to ensure CSC signaling. Aiming for robust identification of CSC, we propose a complementary approach, combining functional and phenotypic evaluation. Sphere-forming capacity, self-renewal and sphere projection area establish CSC functional properties. Additionally, characterization comprises flow cytometry evaluation of the markers, represented by CD44+/CD24- and CD133, and Western blot, considering ALDH. The presented protocol was also optimized for primary tumor samples, following a sample digestion procedure, useful for translational research.

The aim of this methodology is to identify cancer stem cells (CSC) in cancer cell lines and primary human tumor samples with the sphere-forming protocol, in a robust manner, using functional assays and phenotypic characterization with flow cytometry and Western blot.

Jinekolojik ve Meme Kanseri Tümörlerinden Kanser Kök Hücre Kürelerinin Alınması

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Kanser Araştırmaları

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for embryo implantation into the uterine lining of the maternal womb. Improper decidualization has been established as a root cause for implantation failure and subsequent early embryo miscarriage. Therefore, understanding the molecular mechanisms underlying decidualization is advantageous to improving the rate of successful births. In vivo based studies of artificial decidualization are often limiting due to ethical dilemmas associated with human research, as well as translational complications within animal models. As a result, in vitro assays through primary cell culture are often utilized to explore the modulation of decidualization via hormones. This study provides a detailed protocol for the isolation of HESC and subsequent artificial decidualization via the supplementation of hormones to the culturing medium. Further, this study provides a well-designed method to knockdown any gene of interest by utilizing lipid-based siRNA transfections. This protocol permits the optimization of culture purity as well as product yield, thereby maximizing the ability to utilize this model as a reliable method to understand the molecular mechanisms underlying decidualization, and the subsequent quantification of secreted agents by decidualized endometrial stromal cells.

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a validated and optimized procedure for the isolation and culture of human endometrial stromal cells to conduct in vitro decidualization assay. Further, this study provides a detailed method to efficiently knockdown a specific gene using siRNAs in human endometrial stromal cells.

Vitro Decidualization için insan endometrium Stromal hücre izolasyon

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can also become diseased and cause morbidity and even death. Model systems to study human endometrial biology have been limited to in vitro culture systems of single cell types. In addition, the epithelial cells, one of the major cell types of the endometrium, do not propagate well or retain their physiological traits in culture, and thus our understanding of endometrial biology remains limited. We have generated, for the first time, endometrial organoids that consist of both epithelial and stromal cells of the human endometrium. These organoids do not require any exogenous scaffold materials and specifically organize so that epithelial cells encompass the spheroid-like structure and become polarized with stromal cells in the center that produce and secrete collagen. Estrogen, progesterone and androgen receptors are expressed in the epithelial and stromal cells and treatment with physiological levels of estrogen and testosterone promote the organization of the organoids. This new model system can be used to study normal endometrial biology and disease in ways that were not possible before.

A protocol to generate human primary endometrial organoids that consist of epithelial and stromal cells and retain characteristics of the native endometrial tissue is presented. This protocol describes methods from uterine tissue acquisition to the histologic processing of endometrial organoids.

Multicellular Human Primer Endometrial Organoidlerin Üretimi

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. Instead, ovarian cancer cells exfoliated from the primary tumor are carried by peritoneal fluid to metastatic sites within the peritoneal cavity. These sites, most notably the abdominal peritoneum and omentum, are organs covered by a mesothelium-lined surface. To investigate the processes of ovarian cancer dissemination, we assembled a complex three-dimensional culture system that reconstructs the lining of the peritoneal cavity in vitro. Primary human fibroblasts and mesothelial cells were isolated from human omentum. The fibroblasts were then mixed with extracellular matrix and covered with a layer of the primary human mesothelial cells to mimic the peritoneal and omental surfaces encountered by metastasizing ovarian cancer cells. The resulting organotypic model is, as shown, used to examine the early steps of ovarian cancer dissemination, including cancer cell adhesion, invasion, and proliferation. This model has been used in a number of studies to investigate the role of the microenvironment (cellular and acellular) in early ovarian cancer dissemination. It has also been successfully adapted to high throughput screening and used to identify and test inhibitors of ovarian cancer metastasis.

Here, we present a protocol to construct a three-dimensional in vitro model of the lining of the peritoneal cavity, composed of primary human mesothelial cells and fibroblasts layered with extracellular matrix, as a tool to investigate ovarian cancer cell adhesion, invasion, and proliferation.

İnsan periton boşluğuna bir Organotipik Kültür Yumurtalık Kanseri Yaygınlaştırılması Erken Adımlar Modelleme

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. ...

Tıp

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized stromal cells and immune cells, are responsible for the secretion of hormonal and inflammatory factors which are critical for successful blastocyst implantation, placental development and play a role in the initiation of labor at term and preterm. Many pregnancy complications can arise from perturbations of a fine balance of different cell populations comprising decidua. Alterations in the proportion of specific decidual cell types may disrupt these crucial processes and increase the risk of developing serious complications of pregnancy, such as embryo implantation failure, intrauterine growth restriction, preeclampsia and preterm labor. The protocol outlined here demonstrates a cost and time effective method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae. By combining enzymatic digestion and gentle mechanical disruption of the decidual tissue, a high yield of decidual cells was obtained with virtually no chorion contamination. Importantly, isolated decidual cells were characterized (stromal cells (55-60%), leukocytes (35%), epithelial (1%) or trophoblast (0.01%) cells) and maintained high viability (80%) which was confirmed by multicolor imaging flow cytometry assay. This protocol is specific to the decidua parietalis and can be adapted to first and second trimester placentae. Once isolated, decidual cells can be used for a multitude of experimental applications aiming to understand the role of different decidual cell sub-populations in pregnancy complications.

This protocol demonstrates a method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae which can be used for a variety of applications (i.e. immunocytochemistry, flow cytometry, etc.) aiming to study the role of different cell populations in pregnancy complications.

Dönem Placentae Fetal membranlar birincil insan Decidual hücre izolasyon

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of luminal and glandular epithelium, a stromal compartment, a vascular network, and a complex immune cell population. Mouse models have been a powerful tool to study the endometrium, revealing critical mechanisms that control implantation, placentation, and cancer. The recent development of 3D endometrial organoid cultures presents a state-of-the-art model to dissect the signaling pathways that underlie endometrial biology. Establishing endometrial organoids from genetically engineered mouse models, analyzing their transcriptomes, and visualizing their morphology at a single-cell resolution are crucial tools for the study of endometrial diseases. This paper outlines methods to establish 3D cultures of endometrial epithelium from mice and describes techniques to quantify gene expression and analyze the histology of the organoids. The goal is to provide a resource that can be used to establish, culture, and study the gene expression and morphological characteristics of endometrial epithelial organoids.

This protocol describes methodologies to establish mouse endometrial epithelial organoids for gene expression and histological analyses.

Fare Rahiminden 3D Endometriyal Organoidlerin Kurulması

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

Biyoloji

Generation and Characterization of Rat Uterus Organoids from Rat Endometrial Epithelial Stem Cells

Endometrial organoids offer valuable insights into the development and pathophysiology of endometrial diseases and serve as platforms for drug testing. While human and mouse endometrial organoids have been developed, research on rat endometrial organoids remains limited. Given that rats can better simulate certain endometrial pathologies, such as intrauterine adhesions, this study aimed to establish rat endometrial organoids. We present a detailed protocol for the isolation and culture of rat endometrial epithelial stem cells (reESCs) and the generation of rat endometrial organoids. Using a refined reESCs expansion medium, we successfully isolated and stably expanded reESCs, demonstrating their long-term culture potential. The reESC-generated organoids exhibited typical structural and functional characteristics of the endometrium, including hormone responsiveness. Our results showed that rat endometrial organoids could be cultured over a long term with stable proliferation, maintaining the glandular structure, cell polarity, and functional characteristics of the endometrial epithelium. This novel rat-derived endometrial organoid model provides a valuable platform for studying endometrial diseases and testing therapeutic interventions, with potential applications across various mammalian species.

Here, we present a protocol to isolate and culture rat endometrial epithelial stem cells (reESCs), generating rat endometrial organoids. This method facilitates in vitro studies of endometrial diseases, enabling gene editing and other cellular manipulations.

Sıçan Endometriyal Epitel Kök Hücrelerinden Sıçan Uterus Organoidlerinin Üretimi ve Karakterizasyonu

Endometrial organoids offer valuable insights into the development and pathophysiology of endometrial diseases and serve as platforms for drug testing. ...

<meta charset="utf8"></head><body>Embriyo İmplantasyon Mekanizmalarını Araştırmak için 3D Baskılı İskele Modeli

Co-culture Model Using Two Types of Adherent Cell Lines

Embryo implantation is affected by the interactions among different cell types in the mother-embryo interface. The direct and indirect communications between various cell types within the decidua are crucial for regulating endometrial receptivity; however, the molecular mechanisms mediating this interaction are still unclear. In this regard, a model to study the implantation process is needed to establish a comprehensive in vitro model that can recapitulate the biology of endometrial epithelium-stroma interaction. This model is composed of regular cell-culture plates and a matching scaffold, which is generated by three-dimensional (3D) printing from low-cost materials. Here, we detail a set of protocols for model construction, cell preparation, cell seeding, cell culture, observation, and evaluation. Furthermore, we have included representative results with cells exhibiting good growth conditions under the microscope. This study aimed to develop in vitro models that would mimic the interaction between endometrial stromal cells and epithelial cells, as well as between trophoblast cells and endometrial cells.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Epitelyal-Stroma ve Embriyo Etkileşimlerini İncelemek için İn Vitro Endometriyal Modeller

The protocol shows a novel in vitro experimental model that can recapitulate the biology of two kinds of adherent cell lines with a three-dimensional (3D)-printed scaffold. The construction of this model and operating procedures, from cell preparation and cell culture to analysis and evaluation, are described.

İki Tip Yapışık Hücre Hattı Kullanan Ko-Kültür Modeli

Embryo implantation is affected by the interactions among different cell types in the mother-embryo interface. The direct and indirect communications ...

Histerektomi Örneklerden İlköğretim İnsan endometrial stroma hücrelerinde Kurulması İçin İki Yöntem

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Fare Endometrial stromal ve epitelyal hücrelerin izolasyonu için

Jinekolojik ve Meme Kanseri Tümörlerinden Kanser Kök Hücre Kürelerinin Alınması

Vitro Decidualization için insan endometrium Stromal hücre izolasyon

Multicellular Human Primer Endometrial Organoidlerin Üretimi

İnsan periton boşluğuna bir Organotipik Kültür Yumurtalık Kanseri Yaygınlaştırılması Erken Adımlar Modelleme

Dönem Placentae Fetal membranlar birincil insan Decidual hücre izolasyon

Fare Rahiminden 3D Endometriyal Organoidlerin Kurulması

Sıçan Endometriyal Epitel Kök Hücrelerinden Sıçan Uterus Organoidlerinin Üretimi ve Karakterizasyonu

İki Tip Yapışık Hücre Hattı Kullanan Ko-Kültür Modeli

İki Tip Yapışık Hücre Hattı Kullanan Ko-Kültür Modeli