Böylece progenitör hücreler, doku homeostazını korumak için çevre ile etkileşime girer. Ve bu protokolü kullanarak, fibroblastların özofagus progenitör hücre davranışını nasıl etkilediğini anlamaya başlayabiliriz. Ko-kültür sistemi, normal özofagus progenitör nişini taklit eden ilk olarak izole edilmiş hücreleri kullanır.
Görüntülemeden önce organoidlerin temizlenmesi, hem hücre etkileşimlerinin hem de organoid morfolojinin analizini sağlar. Bu yöntem insan özofagus organoidlerine uygulanabilir. Örneğin, sağlıklı veya kanser hastalarından gelen materyalleri kullanmak.
Bunu yaparken, kanserle ilişkili fibroblastların spesifik işlevi hakkında bilgi edinebiliriz. Epitel ve stromal hücrelerin ayrışması, canlı organoidler elde etmek için kritik öneme sahiptir. Sindirim altında, düşük hücre verimi ile sonuçlanacak, burada aşırı sindirim hücre canlılığını ve organoid oluşturma kapasitesini azaltacaktır.
Başlamak için, bir diseksiyon mikroskobu ve forseps kullanarak yemek borusunun muscularis eksternasını mekanik olarak çıkarın. Disseke özofagusun distal ucunu bir çift forseps kullanarak tutun ve kası distalden yemek borusunun proksimal ucuna kadar tutmak ve çekmek için diğer forsepsleri kullanın. Kas tabakasını çıkarın ve atın.
Yemek borusunu uzunlamasına açmak için, yemek borusunun bir ucunu tutun ve doku hasarını önlemek için mikro diseksiyon yay makası topunu lümene yerleştirin. Ucunu tutarken yemek borusunu kesin ve 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne veya 24 kuyucuklu bir plakaya yerleştirin. Açılan yemek borusunu HBSS'de mililitre termolizin başına 0.5 miligrama batırın ve 15 dakika boyunca bir rocker çalkalayıcıda 37 santigrat derecede inkübe edin.
Yemek borusunu termolizin çözeltisinden çıkardıktan sonra, özofagus epitelini stromadan dikkatlice ayırın. Epitel ve stromal tabakayı, HBSS'de 200 mikrolitre ayrışma çözeltisi içeren iki ayrı 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve buzun üzerine yerleştirin. Özofagus epitelini keskin bir neşter kullanarak kıyın ve kıyılmış dokuyu Petri kabından 200 mikrolitre ayrışma çözeltisi ile toplayın.
1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 800 mikrolitre taze ayrışma çözeltisi ekleyin ve tüpü kıyılmış epitel tabakası ile 60 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir rocker çalkalayıcıya yerleştirin. Her 15 dakikada bir 200 mikrolitrelik pipet ucu kullanarak çözeltiyi yaklaşık 20 kez yukarı ve aşağı pipetin.
Diseksiyon makası kullanarak stromal tabakayı 200 mikrolitre ayrışma çözeltisi içeren 1.5 mililitrelik bir tüpte ince parçalara ayırın ve 800 mikrolitre taze ayrışma çözeltisi ekleyin. Tüpü 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir rocker çalkalayıcıya yerleştirin. Stromal çözelti için 30 dakikalık inkübasyondan ve epitel çözeltisi için 60 dakikalık inkübasyondan sonra, çözeltiyi 20 kez daha yukarı ve aşağı pipetleyin.
Stromal çözeltiyi 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden ve epitel çözeltisini 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden yeni 1,5 milimetrelik mikro santrifüj tüplerine geçirin. Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 300G'de santrifüj yapın ve fazla sıvıyı bir mililitrelik pipetle çıkararak süpernatantı atın. Pelet 200 mikrolitre antikor karışımında tekrar askıya alın.
Karışımı bir akış sitometri tüpüne aktardıktan sonra, hücreleri dört santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin. Üç mililitre% 1 FBS ekleyin ve beş dakika boyunca tekrar santrifüj yapın. Daha sonra hücreleri en az% 1 FBS'nin en az 200 mikrolitresinde yeniden askıya alın.
Canlı hücreleri izole etmek için faks sıralamadan beş dakika önce bir ila 10.000 seyreltilmiş ölü hücre leke işaretleyicisi ekleyin. Sıralanmış epitel hücrelerini ve fibroblastları bir tüpte bir ila iki oranında karıştırın. Beş dakika boyunca 300 G'de santrifüj yaptıktan sonra, süpernatantı 200 mikrolitrelik bir pipetle dikkatlice çıkararak atın.
Peletleri soğuk, bazik organoid ortamda tekrar askıya alarak hücreleri bir kez yıkayın ve beş dakika boyunca tekrar santrifüj yapın. Hücreleri buzun üzerine yerleştirin ve süpernatantı 200 mikrolitrelik bir pipetle dikkatlice çıkararak atın. Hücreleri kubbe başına 10 mikrolitre matris karışımında tekrar askıya alın ve tüpü tekrar buza koyun.
Önceden ısıtılmış 48 kuyu plakasını 37 santigrat derece inkübatörden alın ve kuyu başına bir matris kubbesi yapın. 20 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, organoid ko-kültürler içeren matris kubbelerine 200 mikrolitre önceden ısıtılmış, ER düşük ortam ve sadece epitel organoidleri içeren ilgili matris kubbelerine ENR ortamı ekleyin. Plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir inkübatöre yerleştirin.
Ve ilk iki gün boyunca, ortamı 10 mikromolar kaya inhibitörü ile destekleyin. Organoid ortamı çıkarın ve matris kubbelerine 200 mikrolitre buz gibi PBS ekleyin. Plakayı beş ila 10 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirdikten sonra, pipet yukarı ve aşağı doğru pipet yapın ve çözeltiyi 0,6 mililitrelik yapışkan olmayan bir tüpe aktarın.
Organoidlerin dibe çökmesine izin vermek için 100G'de 30 ila 60 saniye boyunca kısa bir süre santrifüj yapın. Fazla sıvıyı çıkardıktan sonra, tüpe buz gibi soğuk PBS ekleyin ve 30 ila 60 saniye boyunca tekrar santrifüj yapın. Fazla sıvıyı daha önce gösterildiği gibi çıkarın ve organoidi PBS çözeltisinde 200 mikrolitre soğuk,% 4 formaldehit ile buz üzerinde 30 dakika sabitleyin.
Organoidin batmasına izin vermek ve formaldehiti çıkarmak için tüpü dik olarak yerleştirin. Kalan formaldehiti yıkamak için 500 mikrolitre soğuk PBS ekleyin. Fazla PBS'yi çıkardıktan sonra, 500 mikrolitre blokaj tamponu ekleyin.
Tüpü oda sıcaklığında 60 dakika boyunca bir rocker çalkalayıcıya yerleştirin. Bloke edici tamponu çıkarın ve organoidleri 200 mikrolitre bloke tamponunda primer antikorlarla yeniden askıya alın. Organoidleri tekrar bir gece boyunca dört santigrat derecede bir rocker çalkalayıcıya yerleştirin.
Birincil antikor karışımını çıkarın ve organoidleri PBS'de 500 mikrolitre% 0.02 Triton X 100 kullanarak oda sıcaklığında 60 dakika boyunca yıkayın. Bunu üç kez tekrarlayın. Benzer şekilde, yıkama tamponunu çıkarın ve bloke edici tampona gece boyunca dört santigrat derecede 200 mikrolitre floresan konjuge ikincil antikor ekleyin.
PBS'de% 0.02 Triton X 100 ve ardından 500 mikrolitre PBS kullanarak organoidleri tekrar yıkayın. Tüm fazla sıvıyı çıkardıktan sonra, organoidlere 10 mikrolitre temizleme çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Bir mikroskop slaytına 0,05 milimetre çift taraflı yapışkan dört kuyucuklu bir ara parça yerleştirin.
10 mikrolitre temizleme çözeltisini organoidlerle birlikte bir kuyucuğa ekleyin ve ara parçanın üstüne bir kapak kayması yerleştirin. Konfokal mikroskopi sistemi kullanarak görüntüler elde edin. Özofagus progenitör hücreleri, yüksek entegre beta dört ve e-kadherin ekspresyonuna göre sıralanır.
Epitel hücre izolasyonunun temsili akış sitometrisi grafiği, tüm tek hücrelerden canlı hücrelerin yüzdesini gösterir. Tüm canlı hücrelerden izole integrin beta dört ve e-kadherin progenitör hücrelerinin yüzdesi burada gösterilmiştir. Burada gösterilen akış sitometri grafikleri, izole DPP4 + ve Pdgf reseptör alfa pozitif fibroblastların yüzdesini temsil eder.
Pdgf reseptörü alfa H2 BEGFP pozitif fibroblastlarla birlikte kültürlenen organoidlerle parlak alan görüntüleri nükleer EGFP sinyalini göstermektedir. Altıncı günde tüm matris kubbesinin parlak alan görüntüleri burada gösterilmektedir. Organoid oluşturma verimliliği bu grafiksel görüntü ile sunulmaktadır.
Her nokta bir matris kubbesini temsil eder ve çubuk koşul başına tüm noktaların ortalamasını temsil eder. Burada altıncı gün organoidlerinin Pdgf reseptörü alfa pozitif fibroblastlarla birlikte kültürünün parlak alan ve floresan görüntüleri gösterilmiştir. Birlikte kültürlenmiş organoidlerin tüm montaj görüntüleri, organoidlerin etrafına sarılmış ve organoid ile yakın temas halinde olan vimentin pozitif fibroblastlarla 3D yüzeylerini göstermektedir.
Mono ve kokültüre organoidlerin Pdgf reseptörü alfa pozitif fibroblastlarla boyanması, farklı bazal ve suprabazal hücre popülasyonlarını ortaya koymaktadır. Organoid oluşturma etkinliği ve organoid boyutu, ko-kültüre dahil edilen fibroblasttan etkilenir. Farklı fibroblast alt popülasyonları kullanıldığında varyasyonlar ve sonuçlar beklenir.
Aynı strateji, hem farelerde hem de insanlarda tümörle ilişkili fibroblastları karakterize etmek için kullanılabilir.
