Bu protokol, balık toksisitesi testinde farklı potansiyel uygulamalara sahip bir 3D in vitro model olan zebra balığı sferoidlerini kolayca üretebilir. Bu, boyut ve şekil bakımından çok benzer zebra balığı hücre çizgilerinin tek kürelerini üretmek için basit ve hızlı bir yöntemdir. Açıklanan tüm adımları doğru bir şekilde izlerseniz, herhangi bir sorunla karşılaşmamalısınız.
Zebra balığı sferoidleri, kozmetik gibi ürünlerin çevre güvenliği değerlendirmesinin iyileştirilmesine yardımcı olan kimyasalların balıklar üzerindeki etkilerinin araştırılması mekanizmasına büyük fayda sağlayabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan genetik doktoru Irisdoris Rodrigues de Souza olacak. Başlamak için, yaklaşık% 80 birleşimde bir T75 zebra balığı hücresi şişesi alın.
Ortamın tamamını çıkarın ve kültür şişesine bir pipetle 0.01 molar PBS ekleyerek hücreleri yıkayın. Şişeyi hafifçe sallayarak kültür şişesini PBS ile yıkayın ve ardından PBS'yi çıkarın. Kültür şişesine üç mililitre tripsin 0.5 milimolar EDTA ekleyin ve üç dakika boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin.
Hücrelerin şişeden ayrılması için, hücreleri serbest bırakmak için şişeye hafifçe dokunun. Daha sonra şişeye üç mililitre tam kültür ortamı ekleyerek tripsin sindirimini durdurun. Bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne aktarın ve beş dakika boyunca 100 G'de santrifüj.
Sonra süpernatanı dikkatlice çıkarın. Kullanımdaki ilgili hücre hattı için tam ortamın bir mililitresini ekleyin ve bir mikropipet kullanarak peleti yeniden askıya alın. Hücreleri saymak ve canlılıklarını değerlendirmek için bir mikro tüpe 10 mikrolitre hücre süspansiyonu ve 10 mikrolitre Tripan mavisi boya ekleyin.
Hücre süspansiyonunu karıştırın ve bir pipet kullanarak boyayın ve bu karışımın 10 mikrolitresini bir Neubauer odasına aktarın. Odanın köşelerine yerleştirilen dört büyük kare veya kadrandaki hücreleri, Trypan mavisini almayan hücreleri canlı olarak kabul ederek sayın. Ardından, ekranda gösterilen denklemi kullanarak uygulanabilir hücrelerin sayısını hesaplayın.
Hücre süspansiyonundaki son hücre numarasını hesaplamak için bu hücre numarasını iki ile çarpın. Hücre numarasını hesapladıktan sonra, hücre süspansiyonunu, her hücre hattı için gereken hücre sayısı ile 96 delikli yuvarlak tabanlı bir ULA plakasının kuyucuğu başına bu süspansiyonun 200 mikrolitresini plakalayacak şekilde ayarlayın. Süspansiyonu, orta bir rezervuardaki ayarlanmış hücre konsantrasyonuyla hazırlayın ve köpük veya kabarcık oluşturmadan çok kanallı bir mikropipet kullanarak karıştırın.
Yuvarlak tabanlı ULA plakasının her bir kuyucuğuna 200 mikrolitre ayarlanmış hücre süspansiyonu ekleyin. çok kanallı pipet kullanarak. 96 delikli plakadan kültür ortamı buharlaşmasını önlemek için plaka Parafilm veya yapışkan sızdırmazlık folyosu ile kapatılmalıdır.
Plakayı, karbondioksitsiz 28 santigrat derecelik bir inkübatörde beş gün boyunca 70 RPM'de yörüngesel bir çalkalayıcıda inkübe edin. Beş gün sonra, üretilen sferoidleri değerlendirmek için ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu altında sferoidleri gözlemleyin. Şekillerini ve boyutlarını ölçmek için, sferoidlerin resimlerini elde edin ve görüntüleri işlemek ve analiz etmek için yazılım kullanın.
Yazılımı seçilen bir alanı bilinen bir ölçeğe göre ölçecek şekilde ayarladıktan sonra, alanını ve daireselliğini belirlemek için kürenin dış tarafını seçin. Sferoidin alanı, çapı, d'yi hesaplayarak boyutunu belirlemek için kullanılır ve yazılım, seçilen alanı ve çevreyi kullanan bir formülle sferoidin daireselliğini sağlar. Orbital sarsıntının ilk gününde bir ZFL hücre agregası oluşur.
Hücre agregası üçüncü günde daireselliğini arttırır ve beşinci günde yeterli bir küresel şekle ulaşır. Burada ULA plakasında 16 günlük bir ZFL sferoid gösterilmektedir. ZEM2S hücre hattı, orbital sarsıntının ilk gününden itibaren sferoidler oluşturur.
Küre şeklini korur ve üçüncü günde büyüklüğü artar ve maksimum daireselliğine beşinci günde ulaşılır. Burada bir ULA plakasında 10 günlük bir ZEM2S sferoidi gösterilmektedir. ZFL ve ZEM2S hücre hatlarının sferoidlerinin ölçülen büyüklüğü ve ZFL ve ZEM2S sferoidlerinin ölçülen dairesellik indeksi bu şekilde gösterilmiştir.
Bu grafik görüntü, ZFL ve ZEM2S sferoidlerinin büyüme modelini temsil etmektedir. Burada 100 RPM'de beş günlük orbital sarsıntıdan sonra oluşan bir ZFL sferoid ve ZEM2S sferoidi gösterilmektedir. 70 ve 100 RPM dönme hızlarında oluşan sferoidlerin büyüme paterni ve dairesellik indeksi bu şekilde sunulmuştur.
70 RPM, bu yöntemle ZFL ve ZEM2S sferoidlerini oluşturmak için en uygun hızdır. Hücre zarlarının Lectin Alexa Fluor 594 ve çekirdeklerin DAPI ile boyanması, sferoidlerin çekirdeğindeki hücresel bütünlüğü göstermektedir. AlamarBlue'nun indirgenmesiyle oluşan resorufinin floresansı, her iki sferoidin çekirdeğinde canlı hücreler gösterir.
ZEM2S ve ZFL hücre hattının 3D kültüründe ve 2D kültüründe MTT canlılık testi burada gösterilmekte ve anlamlı bir fark göstermemektedir. Bu prosedürü denerken, kültür ortamının pH'ını değiştirmekten ve kuyucuklarda buharlaşmayı önlemek için plakaları kapattığınızdan emin olun. Sferoidler, balık karaciğerindeki toksik etkileri değerlendirmek için çeşitli in vitro testlerde veya embriyo ZEM2S hücre hattını kullanarak gelişimsel çalışmalarda uygulanabilir.
Bu protokol, in vitro balık testinin geliştirilmesinin ilerlemesine yardımcı olabilir ve hayvan bazlı olmayan ekotoksisite çalışmalarının ilerlemesine katkıda bulunabilir.
