פרוטוקול זה יכול ליצור בקלות ספרואידים של דגי זברה, מודל תלת-ממדי במבחנה עם פוטנציאל יישום שונה בבדיקת רעילות דגים. זוהי שיטה פשוטה ומהירה ליצירת ספרואידים בודדים של קווי תאים של דגי זברה דומים מאוד בגודל ובצורה. אם בצע את כל השלבים המתוארים כראוי, אחד לא צריך להיתקל בבעיות.
ספרואידים של דגי זברה עשויים להועיל מאוד למנגנון, חקר ההשפעות של כימיקלים על דגים, מה שעוזר לשפר את הערכת הבטיחות הסביבתית של מוצרים כגון קוסמטיקה. מי שתדגים את ההליך תהיה איריסדוריס רודריגז דה סוזה, רופאה לגנטיקה מהמעבדה שלי. בתור התחלה, קחו בקבוק T75 של תאי דגי זברה במפגש של כ-80%.
הסר את המדיום השלם, ושטוף את התאים על ידי הוספת PBS טוחנת 0.01 לבקבוק התרבית עם פיפט. שטפו את בקבוק התרבית עם PBS על ידי ניעור עדין של הבקבוק ולאחר מכן הסירו את PBS. מוסיפים שלושה מיליליטר טריפסין 0.5 מילימולר EDTA לבקבוק התרבית, ודגרים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות.
לניתוק התאים מהצלוחית, טפחו בעדינות על הבקבוק כדי לשחרר את התאים. ואז לעצור את העיכול טריפסין על ידי הוספת שלושה מיליליטר של מדיום תרבית מלאה לצלוחית. באמצעות פיפט, להעביר את מתלה התא לצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מיליליטר צנטריפוגה צנטריפוגה ב 100 G במשך חמש דקות.
לאחר מכן הסר בזהירות את supernatant. הוסף מיליליטר אחד של המדיום המלא עבור קו התאים המתאים בשימוש והשהה מחדש את הגלולה באמצעות מיקרופיפט. הוסף 10 מיקרוליטר של תרחיף התא ו -10 מיקרוליטר של צבע כחול טריפאן לצינור מיקרו כדי לספור את התאים ולהעריך את הכדאיות שלהם.
מערבבים את תרחיף התא וצובעים באמצעות פיפט, ומעבירים 10 מיקרוליטר מתערובת זו לתא נויבאואר. ספרו את התאים בארבעת הריבועים או הרבעים הגדולים הממוקמים בפינות החדר, תוך התחשבות בתאים שאינם תופסים כחול טריפאן כברי קיימא. לאחר מכן חשב את מספר התאים בני קיימא באמצעות המשוואה המוצגת על המסך.
הכפל מספר תא זה בשניים כדי לחשב את מספר התא הסופי בהשעיית התא. לאחר חישוב מספר התא, התאם את תרחיף התא לצלחת 200 מיקרוליטר של תרחיף זה לכל באר של לוח ULA תחתון עגול של 96 בארות עם מספר התאים הדרוש לכל קו תא. מכינים את התרחיף עם ריכוז התאים המותאם במאגר בינוני ומערבבים אותו באמצעות מיקרופיפט רב ערוצי מבלי ליצור קצף או בועות.
הוסף 200 מיקרוליטר של תרחיף התא המותאם לכל באר של צלחת ULA התחתונה העגולה. באמצעות פיפטה רב ערוצית. הצלחת חייבת להיות אטומה עם Parafilm או נייר איטום דבק כדי למנוע אידוי בינוני תרבית מן הצלחת 96 בארות.
לדגור על הצלחת על שייקר מסלול במהירות 70 סל"ד למשך חמישה ימים באינקובטור של 28 מעלות צלזיוס ללא פחמן דו חמצני. לאחר חמישה ימים, התבונן בכדורידים תחת מיקרוסקופ אור הפוך כדי להעריך את הספרואידים שנוצרו. כדי למדוד את צורתם וגודלם, קבל תמונות של הספרואידים, והשתמש בתוכנה כדי לעבד ולנתח את התמונות.
לאחר הגדרת התוכנה למדידת אזור נבחר בהתבסס על קנה מידה ידוע, בחר את הצד החיצוני של הספרואיד כדי לקבוע את שטחו ואת מעגליותו. שטח הספרואיד משמש לקביעת גודלו על ידי חישוב הקוטר, d, והתוכנה מספקת את המעגליות של הספרואיד על ידי נוסחה המשתמשת בשטח ובהיקף שנבחרו. צבר תאי ZFL נוצר ביום הראשון של רעידות מסלוליות.
צבר התא מגביר את המעגליות שלו ביום השלישי, ומגיע לצורה כדורית נאותה ביום החמישי. ספרואיד ZFL בן 16 יום בצלחת ULA מוצג כאן. קו התאים ZEM2S יוצר ספרואידים מהיום הראשון של רעידות מסלוליות.
הספרואיד שומר על צורתו וגדל בגודלו ביום השלישי, והמעגליות המקסימלית שלו מגיעה ביום החמישי. ספרואיד ZEM2S בן 10 ימים בצלחת ULA מוצג כאן. הגודל הנמדד של ספרואידים של קווי התאים ZFL ו- ZEM2S ומדד המעגליות הנמדד של ספרואידים ZFL ו- ZEM2S מוצגים באיור זה.
תמונה גרפית זו מייצגת את דפוס הצמיחה של כדורי ZFL ו- ZEM2S. ספרואיד ZFL וספרואיד ZEM2S שנוצרו לאחר חמישה ימים של רעידות מסלוליות ב-100 סל"ד מוצגים כאן. דפוס הצמיחה ומדד המעגליות של הספרואידים שנוצרו במהירויות סיבוב של 70 ו -100 סל"ד מוצגים באיור זה.
70 סל"ד היא המהירות המתאימה ביותר ליצירת ספרואידים ZFL ו- ZEM2S בשיטה זו. צביעה של קרומי תאים על ידי Lectin Alexa Fluor 594 וגרעינים על ידי DAPI מדגימה את שלמות התא בליבת הספרואידים. פלואורסצנטיות של resorufin שנוצר על ידי הפחתה של AlamarBlue מדגים תאים קיימא בליבה של שני הספרואידים.
בדיקת כדאיות MTT בתרבית תלת-ממדית ובתרבית דו-ממדית של קו התאים ZEM2S ו-ZFL מוצגת כאן, ללא הבדלים משמעותיים. בעת ניסיון הליך זה, הקפד לאטום את הלוחות כדי למנוע שינוי ה- pH של אמצעי התרבות ואידוי בבארות. הספרואידים יכולים להיות מיושמים במגוון בדיקות חוץ גופיות כדי להעריך השפעות רעילות בכבד דגים או מחקרים התפתחותיים באמצעות קו תאי ZEM2S עובר.
פרוטוקול זה יכול לעזור לדחוף קדימה את הפיתוח של ניסויי דגים במבחנה, ולתרום להתקדמות של מחקרי רעילות אקולוגית ללא בעלי חיים.
