Bu protokol, sitopatik etkiye dayanmadan Zika virüsünün tanımlanmasını ve ölçülmesini sağlar. Virüs bileşeninin antikor tanımasına bağlıdır. Virüse özgü antikorun kullanımı, karışık popülasyonlarda farklı virüs serotiplerinin belirlenmesine yardımcı olabilir.
Bu yöntemin klasik plak oluşturan tahlillere göre avantajları vardır. Daha hızlıdır ve hızlı hücre sayımı için otomatik bir görüntüleme sistemi ile uygulama yaparken yüksek verimli uygulamalar için etkinleştirilmiştir. Önerilen protokol son derece uyarlanabilir.
Uygun modifikasyonlarla, önerilen protokol çeşitli hücre tiplerine ve viral hedeflere uygulanabilir. Vero hücrelerini% 10 FBS ve iki milimol L-glutamin ile desteklenmiş 12 mililitre DMEM içeren 75 kare = santimetrelik bir hücre kültürü şişesinde büyüterek başlayın. Şişeyi 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.
Hücre tek tabakasını enfekte etmek için, büyüme ortamını hücre kültürü şişesinden çıkarmak için 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanın. Beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak, şişeyi iki kez üç mililitre DPBS ile durulayın. Daha sonra, hücre kültürü şişesine iki mililitre serumsuz DMEM ve 20 mikrolitre Zika virüsü aşısı ekleyin.
Şişe, virüs adsorpsiyonunu teşvik etmek için hafifçe sallayarak oda sıcaklığında bir saat inkübe etmesine izin verin. İnkübasyonun sonunda, beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak, seyreltilmiş virüs inokulumunu hücre kültürü şişesinden dikkatlice çıkarın ve atın. Hücre kültürü şişesini üç mililitre DPBS ile iki kez durulayın.
Ardından, enfekte olmuş hücreleri korumak için hücre kültürü şişesine 12 mililitre bakım ortamı ekleyin. Enfekte olmuş Vero hücrelerini 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir hücre kültürü inkübatöründe üç gün boyunca inkübe edin. Üç günlük inkübasyondan sonra, Zika virüsünü içeren hücre kültürü süpernatanını 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne toplamak için 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanın.
Virüs ölçümü için, Vero hücrelerini belirlenmiş plakalarda tohumlayın ve% 5 karbondioksit atmosferi ile 37 santigrat derecede gece boyunca büyümelerine izin verin. Negatif kontrol için ekstra bir tüp de dahil olmak üzere on kat seri seyreltme gerçekleştirmek için her plaka için altı steril 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpü hazırlayın. 24 oyuklu bir plaka kurulumu için, altı mikrosantrifüj tüpünün tümüne 450 mikrolitre serumsuz DMEM ekleyin.
96 oyuklu bir plaka kurulumu için, altı ek tüpe 135 mikrolitre serumsuz DMEM dağıtın. 24 oyuklu plaka deneyi için seri seyreltme yapmak için, 450 mikrolitre serumsuz DMEM içeren 10 ila eksi bir tüpe 50 mikrolitre Zika virüsü stoğu ekleyin. 96 oyuklu plaka deneyi için, 135 mikrolitre serumsuz DMEM içeren 10 ila eksi bir tüpe 15 mikrolitre Zika virüsü stoğu ekleyin.
Virüsü ve ortamı iyice karıştırmak için her bir tüpü vorteksleyin ve seyreltme içinde virüs parçacıklarının eşit dağılımını sağlayın. Yeni bir pipet ucu kullanarak, 10 ila eksi bir tüpü yeniden süspanse edin ve 50 ve 15 mikrolitre seyreltilmiş Zika virüsünü, sırasıyla 24 ve 96 oyuklu plakalar için ikinci bir on kat seyreltme olarak 10 ila eksi iki tüpe aktarın. Uygun plakanın her bir oyuğu için koşul ortamını çıkarın ve atın.
Kalıntıları gidermek için her bir kuyuyu DPBS ile iki kez durulayın. En yüksek seyreltmeden başlayarak, seri olarak seyreltilmiş virüs aşısını kuyucuklara ekleyin ve en düşük seyreltmeye doğru çalışın. Bir saatlik inkübasyondan sonra, virüs süspansiyonunu en düşük konsantrasyondan en yüksek konsantrasyona kadar kuyulardan çıkarın ve atın.
Virüs süspansiyonu izlerini gidermek için enfekte olmuş hücreleri DPBS ile iki kez yıkayın. Kuyuyu DMEM ve% 1.5 düşük viskoziteli karboksimetilselüloz ile kaplayın. Plakayı% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, kaplama ortamını çıkarın ve atın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. 96 oyuklu plaka için, kaplama ortamını çıkarmak ve atmak için çok kanallı bir pipet kullanın ve hücreleri oyuk başına 60 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın. Hücreleri sabitlemek için% 4 paraformaldehit ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
20 dakika sonra paraformaldehiti atın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, 3, 3'diaminobenzidin peroksidaz substratı ekleyin ve plakayı karanlıkta 30 dakika inkübe edin. 30 dakika sonra, kuyucukları suyla yıkayarak reaksiyonu durdurun.
Plakaları gece boyunca havayla kurutun ve odak sayımına devam edin. Seçilen seyreltmenin her bir kopyası için odakları sayın ve her biri için ortalama odak sayısını hesaplayın. Enfekte Vero hücreleri, enfeksiyondan sonra farklı zaman noktalarında sabitlendi.
2 oyuklu plaka için, virüs odaklarının ilk görünümü enfeksiyondan 48 saat sonra gözlendi, ancak odakların boyutu doğru bir şekilde sayılamayacak kadar küçüktü. Enfeksiyondan 96 saat sonra, hücre dekolmanı belirtisi yoktu. Enfeksiyondan 60 saat sonra, odak boyutu sayım için en uygun seviyeye yükselmiştir.
Daha sonra, zaman ilerledikçe, odaklar büyüdü ve yoğunluk olarak birbirleriyle birleşmeye veya üst üste binmeye başladı ve zamanla büyüyen kümeler oluşturdu. Bu nedenle, enfeksiyondan 60 saat sonra oluşan odaklar, 24 oyuklu bir plakada Zika virüsü titresini belirlemek için seçildi. 96 oyuklu plaka için, hücreler enfeksiyondan 72 saat sonra bozulmadan kaldı.
Virüs odaklarının görünümü ilk olarak enfeksiyondan 24 saat sonra gözlendi. Bununla birlikte, enfeksiyondan 36 saat sonrasına kadar, odakların boyutu çok küçüktü. Optimal odak büyüklüğü enfeksiyondan 48 saat sonra elde edildi.
Daha sonraki zaman noktalarında, üst üste binen veya birleşen odaklar gözlemlendi ve üst üste binen odakların sayısı zamanla arttı. Enfeksiyondan 48 saat sonra oluşan odaklar, Zika virüsü izolatlarının virüs titresini belirlemek için seçildi. DPBS'yi her bir oyuğun kenarına yavaşça ekleyin ve hücresel kalıntıları ve fazla ortamı çıkarmak için plakaları bir ila üç kez ileri ve geri sallayın.
Bu teknik, Zika araştırmalarındaki araştırmacılara büyük fayda sağlayacaktır ve ayrıca klinik olarak önemli diğer virüsleri ölçmek için geniş çapta uyarlanabilir, bu da onu virüs gözetimi ve teşhisi için değerli bir araç haline getirir.
