Literatür, miyokard B hücrelerinin prevalansı hakkında zıt veriler bildirmektedir. Bu muhtemelen perfüzyon ve sindirim tekniklerindeki değişkenlikten kaynaklanmaktadır. Protokolümüz, miyokard B hücreleri üzerinde tekrarlanabilir akış sitometrisine dayalı analizi güçlendirir.
Bu teknik, B hücrelerinin iyileşme verimini en üst düzeye çıkarır ve B hücreleri ve kalp örneklerinden elde edilen diğer popülasyonlar arasındaki akış sitometri sayımlarındaki değişkenliği azaltır. Bu optimize edilmiş sindirim ve izolasyon yöntemi, kalpteki farklı bağışıklık hücresi tiplerini incelemek için genişletilmiş bir antikor paneli uygulamak için kolayca değiştirilebilir. Protokol, bu organlarla ilişkili B hücrelerini incelemek için akciğer veya karaciğer gibi diğer organlara da uygulanabilir.
Başlamak için, 12 haftalık bir erkek fareyi tartın. 100 mikrolitre B220 antikor çözeltisi içeren 310 cc'lik bir insülin şırıngası yükleyin. Seyreltilmiş B220 antikorunu retro-orbital enjeksiyonla enjekte edin ve derhal organ toplama ve perfüzyona geçin.
Ötanaziden sonra, farenin derisini epigastrik bölgede forseps ile tutun. Makas kullanarak ciltte iki milimetrelik bir açıklık açın ve fasya tabakasını ortaya çıkarmak için cildi soymak için forsepsleri kullanın. Epigastriyumda fasya ve periton boyunca kesin.
Hemostatik forseps kullanarak ksifoid işlemi kelepçeleyin. Her iki taraftaki orta klaviküler çizgi seviyesinde göğüs duvarından dikey bir kesim yapın ve mediasten içeriğini ortaya çıkarmak için ön göğüs duvarını kaldırın. Forseps kullanarak aortu arkadan güvenli bir şekilde tutun.
Şırınga iğnesini kalbin tepesine sokun. Dakikada üç mililitre hızında üç mililitre HBSS ile perfüze edilir. Aortu kesin ve kalbi çıkarın.
Petri kabındaki kalbi HBSS ile yıkayın. İzole edilmiş kalbi tartın ve ağırlığı miligram cinsinden not edin. Kalbi oda sıcaklığında bir bıçakla küçük parçalara ayırın.
Kalp parçaları yaklaşık 1,5 milimetre büyüklüğünde olmalıdır. Bir denge kullanarak kalp dokusunun kütlesini ölçün ve üç mililitre HBSS içeren buz üzerine 15 mililitrelik bir tüpte sindirilecek kıyılmış kalbin 60 miligramını yerleştirin. B220 antikor enjeksiyonunu almayan bir fare için bu işlemi tekrarlayın ve üç mililitre HBSS etiketli referans kontrol dokusu içeren tüpe yerleştirin.
Kıyılmış dokular içeren her tüpe enzimler ekleyin. Miligram DNaz I başına 0.5 mikrolitre, miligram kollajenaz II başına bir 0.5 mikrolitre ve miligram hyaluronidaz başına 0.2 mikrolitre ekleyin. Sindirim reaksiyonunu çalkalayıcıya dakikada 300 dönüşte 30 dakika boyunca yerleştirin.
Tüpler çalkalayıcıya küçük bir açıyla, yaklaşık 25 derecelik eğimle yerleştirilir. 15 mililitrelik reaksiyon tüplerinin her birine yedi mililitre HBSS ekleyin ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 250 G'de santrifüj yapın. Süper natantı boşalttıktan sonra, her peleti beş mililitre ACK lizis tamponunda yeniden askıya alın.
Oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Her tüpe 10 mililitre PBS ekledikten sonra, 40 mikrometrelik bir süzgeçle 50 mililitrelik bir tüpe karıştırın ve süzün. Tüm malzemenin filtreden geçmesini sağlamak için filtredeki kalıntıları bir şırınga pistonu ile parçalayın.
Hacim kalp başına 25 mililitreye ulaşana kadar filtreden PBS ekledikten sonra, referans kontrol doku tüpüne ilave 25 mililitre PBS ekleyin ve hacmi iki farklı tüpe bölün. Tüplerden birini lekesiz, diğerini canlı/ölü olarak etiketleyin. Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 250 G'de santrifüj yaptıktan sonra, süpernatantı boşaltın ve lekesiz tüpü 100 mikrolitre PBS'de ve diğer peletlerin her birini canlı / ölü leke çözeltisinin 100 mikrolitresinde yeniden askıya alın.
Karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatın. Her numuneye 500 mikrolitre FACS tamponu ekledikten sonra, 40 mikrometrelik bir filtreden bir FACS tüpüne aktarın. FACS tüplerini dört santigrat derecede beş dakika boyunca 250 G'de reddettikten ve süpernatanı attıktan sonra, peleti 500 mikrolitre FACS tamponunda yeniden askıya alın.
Lekesiz ve canlı/ölü tüpler hariç her tüpe 50 mikrolitre FC blokaj çözeltisi ekleyin. Karıştırın ve beş dakika boyunca inkübe edin. Lekesiz ve canlı/ölü tüpler hariç, her tüpe 50 mikrolitre antikor karışımı çözeltisi ekledikten sonra, buz kovasını alüminyum folyo ile kaplayarak karanlıkta 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Canlı / ölü lekede olduğu gibi, 500 mikrolitre FACS tamponu ile tekrar yıkayın ve 300 ila 500 mikrolitre FACS tamponunda tekrar askıya alın. Cihaz kontrol yazılımını açın. Pencerenin üst kısmında, Edinme sekmesini seçin ve Yeni'ye tıklayın.
Kütüphane bölümünde, Filtre uygulamak için tür alanına PE, PerCP-Cy5.5, parlak menekşe 421, Alexa Fluor 700 ve Zombie Aqua yazın, floro-4'ü seçin ve her birini yazdıktan sonra Ekle'ye tıklayın. Ardından, Gruplar sekmesine gitmek için İleri'yi tıklatın. Şimdi analiz için kalbi eklemek için tüplü sembole tıklayın.
Referans grubuna tıklayın ve bir pencere açılacaktır. Floresan etiketler sütununda, floresan etiketi olarak Zombie Aqua'yı seçin ve her birinin yanındaki kırmızı çöp kutusu simgesine tıklayarak diğerlerini silin. Ardından, Denetim Türü simgesinde Hücreler'i seçin.
Ardından, Kaydet'i tıklatın. İleri'ye tıklayın. Ardından, İşaretçiler sekmesini tıklatın.
Bir tablo görüntülenir. Her floro-4 sütununun ilk satırına karşılık gelen hücre işaretçisini yazın ve Enter tuşuna basın.
Deneysel örneklerin Kaydedilecek Olayları'nda 10 milyon yazın ve referans grubu satırı için aynı alana 200.000 yazın. Kaydet ve Aç'ı tıklayın. Sol altta, Enstrüman Kontrolü'ne tıklayın.
Voltajı FSC 50, SSC 175, SSC-B 175 olarak ayarlayın. Edinme Denetimi'ni seçin. Akış hızı seçeneği için açılır menüden Yüksek'i seçin.
Lekesiz kalp tüpünü vorteksleyin ve numune enjeksiyon portuna güvenli bir şekilde yerleştirin. Yeşil gösterge okunun doğru örneğe işaret ettiğinden emin olun. Ardından, Kaydet'i tıklatın ve olaylar kaydedilene kadar bekleyin.
Aynı şeyi canlı/ölü lekeli kalp dokusu için de yapın. Mix Çöz menüsünü seçin ve kontrolleri ayarlayın. Floresan Etiketi Olarak Otomatik Floresan onay kutusunu seçin.
Ardından, Pozitif/Negatif Popülasyonları Tanımla sekmesine ilerlemek için İleri'yi tıklatın. Bu sekmede, ileri dağılım alanı ile yan dağılım alanının grafiği görüntülenir. İleri dağılım alanı ekseninde 1 ile 4 milyon arasında ve yan dağılım alanı ekseninde 0,2 ila 3 milyon arasında bir alan seçmek için çokgenin noktalarını tıklatıp sürükleyin.
Sağdaki bir sonraki grafikte, V5-A X ekseninde görüntülenecektir. En sağdaki zirvenin yarısını pozitif olarak ve grafiğin sol tarafındaki bir bölgeyi negatif olarak seçmek için kapıları hareket ettirin. Reference Group-Unstained başlıklı çizimde, benzer aralıkta bir popülasyon seçin.
Lekesiz olanlar için pozitif/negatif seçilmemelidir. Canlı Karıştırmayı Kaldırma düğmesine tıklayın. Şimdi deneysel örnekleri alın, tüpü vorteksleyin ve güvenli bir şekilde SIP'e yerleştirin.
Yeşil gösterge okunun doğru örneğe işaret ettiğinden emin olun. Ardından, sitometre yazılımının Edinme Kontrol panelinde Kaydet'i tıklatın ve olaylar kaydedilene kadar bekleyin. Varsayılan Karıştırılmamış Çalışma Sayfası sekmesini seçin.
Üstteki nokta çizim aracını kullanarak FCS-A ve SSC-A grafiği oluşturun. Çokgen seçim aracını kullanarak FSC-A ekseninde 0,4 milyondan yüksek ve SSC-A ekseninde 0,8 milyondan yüksek olayları seçin. Seçimi çift tıklatarak yeni bir grafik oluşturun ve bu yeni grafikte Y ekseni etiketine sağ tıklayın ve canlı/ölü lekeyi seçin.
X ekseni etiketine sağ tıklayın ve Otomatik Floresan A'yı seçin.Canlı/ölü eksende 10 ila beşincinin altındaki tüm olayları seçin. Bunlar canlı hücrelerdir. Bu seçime çift tıklayın.
Yeni grafikte, X ekseni için PerCP-Cy5.5A'yı ve Y ekseni için SSC-A'yı seçin. PerCP-Cy5.5A'nın sağ tarafındaki popülasyonları seçin. Bunlar bağışıklık hücreleridir.
Seçime çift tıklayın. Yeni grafikte, X ekseni için FSC-A'yı ve Y ekseni için ileri dağılım yüksekliğini seçin. FSC-A değeri ile SSC-A değerinin aynı olduğu bir eğilimi izleyen olayları seçin.
Bu, tek hücreleri seçer ve çiftleri ortadan kaldırır. CD45 pozitif tek hücreli popülasyonda yeni bir grafik görüntülemek için bu seçime çift tıklayın. CD45 pozitif tek hücreli popülasyon grafiğinden, X ekseninde parlak mor 421'i ve Y ekseninde SSC-A'yı seçin.
Parlak menekşe 421 ekseninde sağdaki popülasyonu seçin. Bu B hücresi popülasyonudur. B hücresi popülasyonuyla iki yeni çizim oluşturmak için bu popülasyonda iki kez çift tıklatın.
X ekseninde PEA ve Y ekseninde parlak mor 421A ile ilk B hücresi grafiğini kurun. Sağdaki popülasyon intervasküler B hücrelerine karşılık gelir ve soldaki popülasyon interstisyel B hücrelerini temsil eder. Her ikisini de seçin.
X ekseninde Alexa Fluor 700A ve Y ekseninde SSC-A ile ikinci B hücresi grafiğini ayarlayın. Soldaki popülasyon CD11b-negatif hücrelere karşılık gelir ve sağdaki olaylar CD11b-pozitif hücrelere karşılık gelir. Her bölüme sağ tıklayın ve ardından Kapı özellikleri'ne tıklayın.
Olayların sayısını ve üst popülasyonların yüzdelerini görüntülemek için Count ve Parent'a tıklayın. Daha fazla veri analizi için olay sayısını ve yüzdeleri kaydedin. Naif yaralanmamış bir kalpteki çiftlerin çıkarılmasından sonra, CD45 pozitif hücrelerin yaklaşık% 20'sinin CD19 pozitif B hücreleri olması beklenir.
Bu hücrelerin ortalama %5.5'i interstisyel boşlukta bulunur. %94.5'i intravasküler boşluktadır. Kalpte bulunan tüm B hücresi popülasyonundan, sadece% 1.6'sı, CD11b yüzey belirtecine dayanan B1 hücrelerine ve diğer% 98.4'ü B2 hücrelerine karşılık gelir.
Miyokard B hücrelerini akış sitometrisi ile analiz ederken, protokolü uygun şekilde izleyerek kalbi perfüzyon yapmak ve kıymak çok önemlidir. Sindirilmiş kalbin uygun şekilde filtrelenmesi, bağışıklık hücrelerinin iyileşmesini en üst düzeye çıkarmak için de gereklidir.
