Burada, mGluR2'nin konformasyonel dinamiklerini incelemek için tek moleküllü FRET ve doğal bir amino asit birleşmesi yoluyla bölgeye özgü protein etiketlemesi kullandık. Bu, protein yapısını bozmadan protein dinamiklerini incelemeye izin verir. Atomik yapı bir proteinin statik görüntüsünü sağlar.
Bununla birlikte, tek moleküllü FRET, tüm protein hareketini gerçek zamanlı ve çözelti içinde görselleştirmemizi sağlar. Bu yöntem, herhangi bir proteinin dinamiklerini incelemek için uygulanabilir. Ayrıca, protein-protein etkileşimlerini ve sentetik reseptörlerin mühendisliğini incelemek için doğal bir amino asit birleşmesi kullanılabilir.
Örnek yükleme ve görüntülemenin optimizasyonu sabır ve pratik gerektirir. Başlamak için, cam slayt üzerinde delinecek delikleri bir işaretleyici ile işaretleyin. Slayt suya batırılırken slaytta küçük delikler açmak için bir Dremel kullanın.
Slaytları sonikleştirin ve 23 santigrat derecede bir banyo sonikatöründe 30 dakika boyunca asetonda kaymaları örtün. Asetonu slayttan atın ve kayma kavanozlarını kapatın. Su ile iyice durulayın ve 30 dakika boyunca beş molar potasyum hidroksit içinde sonikasyon yapın.
Daha sonra, slaytları durulayın ve örtü kaymasını suyla örtün ve iki dakika boyunca metanol içinde sonikleştirin. Amino tuzlanma adımına kadar metanol ile dolu kavanozları bırakın. Taze hazırlanmış amino tuzlanma karışımını slaytın içine dökün ve kayma kavanozlarını örtün.
Solüsyonu atmadan önce slaytları inkübe edin, sonikleştirin ve tekrar inkübe edin ve kaymaları bir amino tuzlanma karışımında örtün. Daha sonra, kavanozları suyla doldurmadan önce metanol ile yıkayın. Sonra slaytları suyla durulayın.
Hava üfleme ile kurutun ve montaj kutularına yerleştirin. Slayta 60 mililitre PEGylation çözeltisi uygulayın ve üzerine bir kapak kayması yerleştirin. Depolamadan önce PEGile edilmemiş tarafı işaretleyin.
Kuluçkadan sonra, yavaşça sökün ve slaytları durulayın ve kaymaları suyla örtün. Daha sonra havayı üfleyerek kurutun ve PEGylated yüzeyi birbirinden uzağa bakacak şekilde steril 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. HEK 293T hücrelerini% 0.05 tripsin-EDTA ile geçirdikten sonra, hücreleri poli-L / D-lizin örtü kaymalarına tohumlayın.
Standart ortamı, büyüyen hücreler ve metabotropik glutamat reseptörü 2 veya mGluR2 ekspresyonu için AZP takviyeli ortam ile yerleştirin. Daha sonra hücreleri bir transfeksiyon reaktifi ile transfekte edin ve ortamı taze AZP takviyeli ortamla değiştirmeden önce 24 saat boyunca inkübe edin. Alkinli siyanin boyalarla etiketlemeden 20 dakika önce, kapak fişlerini sıcak Kayıt Arabelleği veya RB ile iki kez yıkayın ve AZP içermeyen sıcak bir standart ortama yerleştirin.
Ardından standart ortamı çıkarın ve taze hazırlanmış etiketleme çözeltisini eklemeden önce hücreleri RB ile yıkayın. Karanlıkta 37 santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, etiketleme çözeltisini çıkarın.
Transfekte hücreler içeren kapak fişini RB ile iki kez yıkayın ve aynı ortamda tekrar askıya alın. Daha sonra, hücreleri beş dakika boyunca dört santigrat derecede 1.000 g'da döndürerek pelet edin ve peleti lizis çözeltisinin 80 ila 130 mikrolitresinde yeniden askıya almadan önce süpernatantı çıkarın. Peleti pipetle kırın.
Sonra folyoya sarın ve hücreleri lize etmek için 30 dakika ila bir saat boyunca dört santigrat derecede rocker'a yerleştirin. Çözünmeyen fraksiyonu 20 dakika boyunca 20.000 g ve dört santigrat derecede santrifüjleme ile toplayın. Daha sonra süpernatantı taze bir soğuk tüpe aktarın ve buz üzerinde saklayın.
Sürgüyü ve kapak kaymasını dondurucudan çıkarın ve karanlıkta oda sıcaklığında ısınmalarına izin verin. Çift taraflı bant şeritlerini sürgü ve kapak kayması arasına sıkıştırarak odayı monte edin ve PEGile yüzeylerin akış odasının içini oluşturmasını sağlayın. Pipet ucu kullanarak, bandın kapak kaymasına temas ettiğinden ve kaydırıldığından emin olmak için kapak kaymasına basın.
Kızağın kenarlarına epoksi uygulayın. Her şeride 40 mikrolitre 500 nanomolar NeutrAvidin uygulayın ve nemlendirilmiş karanlık bir kutunun içinde kuluçkaya yatırın. İki dakika sonra, her hazne şeridini 100 mikrolitre T50 tamponu ile yıkayın.
Daha sonra 20 nanomolar biyotinile antikor çözeltisi ekleyin ve şerit başına 200 mikrolitre T50 tamponu ile yıkamadan önce 30 dakika inkübe edin. Bilgisayarı ve mikroskobu açın. Ardından ısınmak için lazerleri açın.
Ardından, EMCCD kamerayı açın ve yazılımı açın. Numune odasını mikroskop aşamasına monte edin ve görüş alanı başına yaklaşık 400 molekül elde etmek için protein örneğini kademeli olarak ekleyin. Odayı, 0.3 birim protocatechuate 3, 4-dioksijenaz ile desteklenmiş 100 mikrolitre görüntüleme tamponu ile yıkayın.
Hem donör hem de alıcı kanallardaki tek moleküllü floresan sinyallerini tespit etmek için kazancı, edinme oranını ve lazer güçlerini ayarlayın. Daha sonra donörü heyecanlandırın ve görüş alanındaki donör moleküllerinin% 80'i fotobeyazlatılana kadar zaman izleri elde edin. Filmin sonunda, bazı moleküller fotobeyazlatılana kadar alıcıyı doğrudan heyecanlandırmak için 640 nanometre lazeri açın.
Görüş alanını değiştirin ve koşul başına üç film toplamak için donör ve kabul edenin uyarılması adımlarını tekrarlayın. Partikül toplamanın tek moleküllü FRET izlerini seçmek için, donör ve alıcı izlerinin toplam yoğunluğunun zaman içinde sabit olduğu izleri seçin. Ardından, donör ve alıcı yoğunluklarında anti-korelasyon değişiklikleri olan izleri seçin.
Tek adımlı fotobeyazlatma gösteren ve beş saniyeden uzun izler taşıyan donör ve alıcı molekülleri seçin. FRET eksikliğini hesaplayın. Son olarak, makalede açıklanan adımları izleyerek Gizli Markov Modellemesi veya HMM ile konformasyonel durumu tanımlayın.
AZP'nin siyanin boyalarla etiketlenmesi, bakır katalizörlü bir sikloekleme reaksiyonu ile sağlandı ve donör ve alıcı floroforlarla etiketlenmiş hücre yüzey popülasyonu ile 548UAA'nın etkili plazma membran etiketlemesi ile sonuçlandı. SDS-PAGE elektroforezinde, tam uzunlukta dimerik mGluR2 ile çakışan 548UAA'yı eksprese eden HEK 293T hücrelerinde 250 kilodaltonda tek bir bant gözlendi. Donör ve alıcı beyazlatma olayları için çoklu kısa ömürlü ve uzun ömürlü temsili seçici izler burada gösterilmiştir.
Konformasyonel durumlar HMM analizi kullanılarak tanımlandı. Ayrık FRET durumları arasındaki geçişler, idealize edilmiş uyumlardan çıkarıldı ve bir geçiş yoğunluğu ısı haritası olarak çizildi. İdealize edilmiş FRET izleri, tanımlanan her onay için bekleme süresi hakkında da bilgi verir.
Tek molekülün donör ve alıcı kanallı izleri burada gösterilmiştir. Ayrıca, tek moleküllü FRET, mGluR2 sistein bakımından zengin alanın dört konformasyonel durumunu ortaya koymaktadır. Tek moleküllü pull-down için verimli pik koruma şarttır ve bu işlem sırasında dikkatli olunmalıdır.
Ek olarak, oksijen süpürücü ajan görüntülemeden hemen önce eklenmelidir. Bu etiketleme yöntemi ve tek moleküllü FRET deneyleri, çoklu reseptörlere uygulanmış ve reseptör aktivasyonu ve reseptör fonksiyonunun modülasyonu mekanizması hakkında yeni bilgiler sağlamıştır.
