Ici, nous avons utilisé le FRET à molécule unique et le marquage de protéines spécifiques au site via une incorporation naturelle d’acides aminés pour étudier la dynamique conformationnelle de mGluR2. Cela permet d’étudier la dynamique des protéines sans perturber la structure des protéines. La structure atomique fournit une image statique d’une protéine.
Cependant, la molécule unique FRET nous permet de visualiser toute la gamme du mouvement des protéines en temps réel et en solution. Cette méthode peut être appliquée pour étudier la dynamique de n’importe quelle protéine. De plus, une incorporation naturelle d’acides aminés peut être utilisée pour étudier les interactions protéine-protéine et l’ingénierie des récepteurs synthétiques.
Le chargement des échantillons et l’optimisation de l’imagerie nécessitent de la patience et de la pratique. Pour commencer, marquez les trous à percer sur la lame de verre avec un marqueur. Utilisez un Dremel pour percer de petits trous sur la glissière pendant que la glissière est plongée dans l’eau.
Sonicer les lames et couvrir les lames d’acétone pendant 30 minutes dans un sonicateur de bain à 23 degrés Celsius. Jetez l’acétone de la lame et couvrez les bocaux. Rincer abondamment à l’eau et sonifier dans de l’hydroxyde de potassium à cinq molaires pendant 30 minutes.
Ensuite, rincez les lames et couvrez le slip avec de l’eau, et soniquez dans le méthanol pendant deux minutes. Laissez les pots remplis de méthanol jusqu’à l’étape de salinisation amino. Verser le mélange de salinisation amino fraîchement préparé dans la lame et couvrir les bocaux.
Incuber, sonifier et incuber à nouveau les lames et couvrir les lames dans un mélange de salinisation amino avant de jeter la solution. Ensuite, lavez les pots avec du méthanol avant de les remplir d’eau. Rincez ensuite les lames à l’eau.
Séchez-les avec de l’air soufflé et placez-les dans les boîtes de montage. Appliquez 60 millilitres de solution de PEGylation sur la lame et placez un couvercle dessus. Marquez le côté non PEGylé avant le stockage.
Après l’incubation, démonter doucement et rincer les lames et couvrir les lames avec de l’eau. Ensuite, séchez-les en soufflant de l’air et placez-les dans un tube stérile de 50 millilitres avec la surface PEGylée face à face. Après avoir passé les cellules HEK 293T avec 0,05% de trypsine-EDTA, ensemencer les cellules sur des lamelles de couverture de poly-L / D-lysine.
Placer le milieu standard avec un milieu supplémenté en AZP pour les cellules en croissance et l’expression métabotropique du récepteur 2 du glutamate ou mGluR2. Ensuite, transfectez les cellules avec un réactif de transfection et incuber pendant 24 heures avant de changer le milieu avec un milieu frais supplémenté en AZP. 20 minutes avant l’étiquetage avec des colorants alcyne cyanine, lavez les feuillets de couverture deux fois avec un tampon d’enregistrement chaud, ou RB, et placez-les dans un support standard chaud sans AZP.
Ensuite, retirez le support standard et lavez les cellules avec RB avant d’ajouter la solution d’étiquetage fraîchement préparée. Incuber pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius dans l’obscurité. Après l’incubation, retirez la solution d’étiquetage.
Lavez deux fois avec le RB le bordereau de couvercle contenant les cellules transfectées et remettez en suspension dans le même milieu. Ensuite, enduisez les cellules en tournant à 1 000 g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes et retirez le surnageant avant de remettre la pastille en suspension dans 80 à 130 microlitres de la solution de lyse. Casser le granulé en le pipetant.
Ensuite, enveloppez-le dans du papier d’aluminium et placez-le sur la bascule à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes à une heure pour lyser les cellules. Enduire la fraction insoluble par centrifugation à 20 000 g et quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, transférez le surnageant dans un tube froid frais et stockez-le sur de la glace.
Retirez la lame et le couvercle du congélateur et laissez-les chauffer à température ambiante dans l’obscurité. Assemblez la chambre en prenant en sandwich les bandes de ruban adhésif double face entre la glissière et le couvercle, en veillant à ce que les surfaces PEGylated forment l’intérieur de la chambre d’écoulement. À l’aide d’une pointe de pipette, appuyez sur le bordereau du couvercle pour vous assurer que le ruban entre en contact avec le bordereau et la glissière du couvercle.
Appliquez de l’époxy sur les bords de la lame. Appliquez 40 microlitres de NeutrAvidine 500 nanomolaires sur chaque voie et incuber dans une boîte sombre humidifiée. Après deux minutes, lavez chaque voie de chambre avec 100 microlitres de tampon T50.
Ajouter ensuite 20 nanomolaires solution d’anticorps biotinylés, et incuber pendant 30 minutes avant de laver avec 200 microlitres de tampon T50 par voie. Allumez l’ordinateur et le microscope. Allumez ensuite les lasers pour vous réchauffer.
Ensuite, allumez la caméra EMCCD et ouvrez le logiciel. Montez la chambre d’échantillonnage sur la platine du microscope et ajoutez l’échantillon de protéines progressivement pour obtenir environ 400 molécules par champ de vision. Lavez la chambre avec 100 microlitres de tampon d’imagerie complété par 0,3 unité de protocatéchuate 3, 4-dioxygénase.
Ajustez le gain, le taux d’acquisition et les puissances laser pour détecter les signaux de fluorescence d’une seule molécule dans les canaux donneur et accepteur. Ensuite, excitez le donneur, et acquérez des traces temporelles jusqu’à ce que 80% des molécules donneuses dans le champ de vision soient photoblanchies. À la fin du film, allumez le laser de 640 nanomètres pour exciter directement l’accepteur jusqu’à ce que certaines molécules soient photoblanchies.
Changez le champ de vision et répétez les étapes pour excitation du donneur et de l’accepteur afin de collecter trois films par condition. Pour sélectionner des traces FRET à molécule unique de prélèvement de particules, sélectionnez les traces où l’intensité totale des traces donneuses et accepteuses est stable dans le temps. Sélectionnez ensuite les traces avec des changements anti-corrélés dans les intensités donneur et accepteur.
Sélectionnez les molécules donneuses et acceptrices montrant un photoblanchiment en une seule étape et des traces de plus de cinq secondes. Calculez le déficit FRET. Enfin, identifiez l’état conformationnel par modélisation de Markov cachée, ou HMM, en suivant les étapes décrites dans le manuscrit.
Le marquage de l’AZP par des colorants cyanine a été réalisé par une réaction de cycloaddition catalysée par le cuivre et a abouti à un marquage efficace de la membrane plasmique de 548UAA avec la population de surface cellulaire marquée avec des fluorophores donneurs et acceptants. Dans l’électrophorèse SDS-PAGE, une seule bande à 250 kilodaltons a été observée dans les cellules HEK 293T exprimant 548UAA, ce qui coïncidait avec le dimère pleine longueur mGluR2. Des traces sélectives représentatives pour de multiples événements de blanchiment de courte durée et de longue durée pour donneurs et accepteurs sont présentées ici.
Les états conformationnels ont été identifiés à l’aide de l’analyse HMM. Les transitions entre les états FRET discrets ont été extraites des ajustements idéalisés et tracées sous la forme d’une carte thermique de densité de transition. Les traces FRET idéalisées fournissent également des informations sur le temps de séjour pour chaque confirmation identifiée.
Les traces de la molécule unique avec le canal donneur et accepteur sont montrées ici. De plus, la molécule unique FRET révèle quatre états conformationnels du domaine riche en cystéine mGluR2. Une préservation efficace des pics est essentielle à l’extraction d’une seule molécule, et des précautions doivent être prises pendant ce processus.
De plus, l’agent piégeur d’oxygène doit être ajouté immédiatement avant l’imagerie. Cette méthode de marquage et les expériences FRET à molécule unique ont été appliquées à plusieurs récepteurs et ont fourni de nouvelles informations sur le mécanisme d’activation des récepteurs et la modulation de la fonction des récepteurs.
