Bu protokolün önemi, prematüre epitelin in vitro modelinde enteroidlerin brüt olasılığını test etmektir. Bu tekniğin temel avantajı, bağırsak luminal ortamını taklit eden kapalı bir lümenden geçirgenliği ölçmektir. Bu protokol, sızdıran bağırsak hastalığını indükleyen veya zayıflatan faktörleri incelemek için kullanılabilir.
Vasküler sızıntıyı indükleyebilecek koşulları incelemek için endotel veya vasküler sistemlere de uygulanabilir. Bu protokol biraz pratik gerektirir. Tüm prosedürü bir araya getirmeden önce her bölümü ayrı ayrı uygulamanızı öneririz.
Başlamak için, bağırsak segmentlerini buz gibi soğuk Dulbecco'nun amfoterasinli PBS'si ile 60 x 15 milimetre karelik bir Petri kabına aktarın ve buz üzerinde 20 dakika bekletin. Bir çift makaslı bir neşter kullanarak, bağırsak segmentlerini üç ila beş milimetre parçaya bölün ve buz üzerinde 0,5 ila bir mililitre organoid büyüme ortamı içeren 35 x 15 milimetrelik bir Petri kabına bir ila iki parça yerleştirin. Diseksiyon mikro makas ve forseps kullanarak bağırsak tüpünü uzunlamasına kesin.
Daha sonra epitel hücrelerini fasyadan kazımak için forsepsleri kullanın. Fasyayı çıkarın ve hücre kümelerini kırmak için çanağı döndürün. Daha sonra, 20 mikrolitrelik bir pipet kesme ucu kullanarak, hücreleri ve ortamı beş ila 10 mikrolitrelik bir artışla, 285 mikrolitrelik bir çözelti oluşturmak için bir bazal membran matris karışımına aktarın.
200 mikrolitrelik bir kesme ucu kullanarak buz üzerindeki bir bazal membran matrisinde pipetleme yaparak hücreleri karıştırın. Karıştırdıktan sonra, hücre bazal membran matris karışımının beş adet 50 mikrolitrelik şeridini, ılık bir köpük tuğla üzerinde tutulan önceden ısıtılmış altı delikli bir plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin. Polimerizasyona ve bazal membran matrisinin sertleşmesine izin vermek için plakayı 10 dakika boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.
Matris şeritleri katılaştıktan sonra, plakayı inkübatöre geri koymadan önce kuyuya iki mililitre enteroid büyüme ortamı ekleyin. Enteroidleri altı kuyucuklu veya 12 delikli bir plakanın kuyusuna aktardıktan sonra, her alternatif gün, eski medyayı taze ortamla değiştirin. Enteroidler gelişmeye başladığında, hücreleri her beş ila yedi günde bir geçirin.
İmmünofloresan boyama için, enteroidlerin her bir kuyucuğuna tampon bloke etmek için 500 mikrolitre birincil antikor ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, antikor çözeltisini çıkarın ve enteroidleri PBS ile üç kez yıkayın. Bir ila 400 seyreltilmiş ikincil antikor çözeltisinde inkübasyondan sonra, ardından DAPI'de inkübasyondan sonra, enteroidleri PBS ile üç kez yıkayın.
Enteroidlerin üç boyutlu yapılarını korumak için, alt cam slayt ile kapak kayması arasında 0,5 ila bir milimetre boşluk oluşturmak için ince silikon kauçuk levha veya cam kapak kaymaları kesikleri kullanın. Montaj için, lekeli enteroidleri% 70 gliserol ile yıkayın. Daha sonra, bir mikrolitrelik bir aşılama döngüsü veya kesilmiş 200 mikrolitrelik bir uç kullanarak, enteroidleri plakadan çıkarın ve gliserol ile bir cam mikroskop slaydına monte edin.
Şeffaf bir film kapağı ile kaplı bir Petri kabı hazırlayın ve filme iki ila dört adet bir mikrolitrelik Dextran-FITC damlası ekleyin. Mikro manipülatörü kullanarak, mikro pipet ucunu sıvının içine ve filmin üzerine stereo mikroskop altında sürün, ardından Dextran-FITC'yi mikro pipete çekmek için şırıngayı yavaşça çekin. Mikro pipeti iki ila dört mikrolitre Dextran-FITC ile doldurduktan sonra, pipet ucundaki havayı gidermek için şırıngayı itin.
Ayrıca, hava cebinin olmadığından emin olmak için mikro pipetteki enjekte edilen malzeme sütununu kontrol edin ve mikro pipetin içindeki Dextran-FITC hacmini kaydedin. Ardından, pompayı açmadan ve pompa süresini 10 ila 15 milisaniyeye ayarlamadan önce pnömatik pompaya bağlı hava kaynağını açın. Ardından, pompadan mikro pipete giden hattı açmak için şırıngadaki musluğu çevirin.
Enteroidleri inkübatörden çıkarın ve mikro enjeksiyondan sonra ışığa maruz kalmayı en aza indirmek için tabağı kapalı bir kapta ılık bir köpük tuğla üzerine yerleştirin. Petri kabını enteroidlerle stereo mikroskobun altına yerleştirin ve mikro pipet ucunu yatay yüzeye 35 ila 45 derecelik bir açıyla yerleştirmek için mikro manipülatör düğmelerini hareket ettirin. Küresel enteroidleri, çanak başına üç ila beş enteroid enjekte etme hedefiyle görselleştirin ve tanımlayın.
Ardından, mikroskop göz parçalarına bakarak ucu bir hedef enteroide ilerletin. Ardından, Z ekseni düğmesini hassas bir yavaş hareketle ilerleterek, enteroidi mikro pipet ucuyla delin. Uç, enteroid yüzeyden geçtikten sonra ilerleme durmalıdır, bu da bastırır ve geri patlar.
Bir ayağınızla pompa pedalına dokunun ve enteroidi genişleyene kadar yeşilimsi Dextran-FITC çözeltisiyle doldurun. Pompalanan hacmi ve Dextran konsantrasyonunu hesaplamak için pompa sayısını kaydedin. Bu protokol, intestinal epitele özgü çeşitli biyobelirteçlerin immünofloresan antikorlarla boyanarak ince bağırsak epitel orijinallerini doğrulayarak fetal doku kaynaklı enteroidlerin karakterizasyonunu göstermiştir.
Farklı aşamalardaki enteroidler burada gösterilmiştir. Yedi ila 10 günlük bir enteroid küçük ve kalındır. Oysa mikroenjeksiyona hazır bir enteroid, lümen ve ince bir duvarla büyüktü.
Mikroenjeksiyondan iki gün sonra enteroid hala önemli miktarda Dextran-FITC içerir. Mikroenjeksiyon sonrası enteroidlerin geçirgenliği, ortamdaki Dextran konsantrasyonu ölçülerek değerlendirildi. Dar kavşaklarda membran geçirgenliğini arttırdığı bilinen EGTA, pozitif kontrol olarak kullanılmıştır.
Dextran ölçüm testi ayrıca LPS'nin artan geçirgenliği indüklediğini ve daha yüksek LPS konsantrasyonunun daha yüksek geçirgenliğe neden olduğunu göstermektedir. Sabitleme ve boyama ile ilgili en önemli şey, enteroidlerin şeklini bozmamak veya işlem sırasında onları kaybetmemektir. Mikro-enjeksiyonu takiben, sitokin testi için ortam toplanabilir ve RNA dizilimi için enteroidler toplanabilir.
