Bu protokol, deniz eleganlarının mekanik bozulmasını göstermektedir. 96 kuyu formatında, bireysel solucanlarda bakteri yükünün orta verim miktarına izin verir. Bu teknik, Pasel tabanlı yöntemlere kıyasla mekanik bozulmanın hızını ve homojenliğini arttırır, araştırmacıların yüksek kaliteli tek solucan ölçümlerinden oluşan daha büyük veri setlerini kolayca üretmelerini sağlar.
Bu teknik birçok hareketli parçayı içerir ve yerinizi kaybetmek kolaydır. Başlamadan önce tüm malzemeleri, etiketli tüpleri, tamponları ve plakaları ayarladığınızdan emin olun. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir araştırma uzmanı lideri olan Megan Taylor olacak.
Solucan örneğini bir mililitre M dokuz TX sıfır bir mikro santrifüj tüpünde yeniden askıya alarak başlayın. Yetişkin solucanları santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı atın. Aynı santrifüj parametrelerini kullanarak.
Dış bakterileri en aza indirmek için solucanları iki kez bir mililitre M9TX01 ve bir mililitre M9 solucan tamponu ile durulayın. Daha sonra, her bir numuneyi bir mililitre S ortamında ve iki x ısı bir kültür tüpünde OP50'yi öldürürken yeniden askıya alın. Tüpleri, yapışmamış bakterileri bağırsaktan geçirmek için 20 ila 30 dakika boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin.
Kuluçkadan sonra, temizlenmiş solucanları bir mililitre soğuk M9TX01 ile iki kez durulayın ve süper natantı atın. Solucanları felç etmek için tüpleri 10 dakika boyunca buz üzerine koyun. Daha sonra her tüpe kokusuz ağartıcı ile bir mililitre buz gibi soğuk M dokuz solucan tamponu ekleyin.
Dış bakterileri öldürmek için tüpleri buz üzerinde en az 10 dakika inkübe edin. Ağartıcı tamponunu atın ve solucanların pompalanmasını önlemek için tüpleri buza geri koyun. Ardından, her tüpe bir mililitre soğuk M9TX01 ekleyin ve beş saniye boyunca santrifüj yapın.
Mini bir santrifüjde. Tüpleri buza geri döndürün ve süpernatanı çıkarın. Bu adımı bir kez tekrarlayın.
Solucan kütikülünün kimyasal geçirgenliği için. Solucanları içeren tüpleri 20 mikrolitre tamponda oda sıcaklığında bir tüp rafına aktarın. Daha sonra her sıcak numuneye 100 mikrolitre SDS/DTT çözeltisi ekleyin.
Yetişkin solucanların kütikülünü kısmen parçalamak için tüpleri tezgahta sekiz dakikaya kadar inkübe edin. Bu noktada, solucanlar ölecek ve tüpün dibine yerleşecektir. Kuluçkadan sonra, SDS / DTT süpernatını dikkatlice atın.
Ardından, her tüpe bir mililitre M9TX01 ekleyin ve solucanları peletlemek için kısaca santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve solucanları% 0.1 Triton x-100 ile bir mililitre M dokuz solucan tamponunda yeniden askıya alın. Solucanların mekanik olarak bozulmasına hazırlanmak için, steril iki mililitre derinliğinde kuyucuk 96 kuyu plakası ve bir silikon plaka kapağı elde edin.
Her bir kuyucuğa az miktarda steril 36 ızgara silikon karbür eklemek için steril bir kepçe spatula kullanın, böylece ızgara kuyunun tabanını zar zor kaplar. Her bir kuyucuğa 180 mikrolitre M dokuz solucan tamponu ekleyin. Kolonları ve sıraları etiketleyin ve ardından plakayı silikon plaka kapağıyla gevşek bir şekilde örtün.
Daha sonra, geçirgen solucanları bir santimetre derinliğe kadar doldurulmuş M9TX01 ile küçük bir Petri kabına aktarın. Diseksiyon yapan bir mikroskop pipetiyle, 20 mikrolitre hacimdeki tek tek solucanları dışarı çıkarın ve pipete yapışmış solucanları çıkarmak için bunları 96 kuyu plakasının ayrı kuyucuklarına aktarın, Petri kabının açık bir alanından 20 mikrolitre M9TX01'i aspire edin ve tekrar tabağa bırakın. Tüm solucanlar aktarıldıktan sonra, 96 kuyu plakasını, kağıt destekli tarafı numune kuyucuklarına bakacak şekilde esnek tavan filmi tabakasıyla örtün.
Silikon tavan paspasını, kapağı kuyucuklara bastırmadan esnek tavan filminin üzerine hafifçe yerleştirin. Bozulma sırasında aşırı ısınmayı önlemek için plakayı 30 ila 60 dakika boyunca dört santigrat dereceye yerleştirin. Plakayı soğuttuktan sonra, silikon tavan paspasını sızdırmaz hale getirmek için kuyucuklara sıkıca bastırın.
Daha sonra doku bozucudaki plakaları sabitleyin. Plakaları 30 hertz'de bir dakika çalkalayın. Ardından plakaları 180 derece döndürün ve bir dakika boyunca sallamayı tekrarlayın.
Esnek tavan filminden herhangi bir kumdan herhangi bir kum çıkarmak için plakaları tezgahın üzerine iki veya üç kez sıkıca dokunun. Kuyucukların dibindeki örnekleri toplamak için plakayı iki dakika boyunca 2.400 kez G olarak ayarlayın. Ardından silikon kapağı çıkarın ve tavan filmini çekin.
Solucan sindirimlerinin on kat seri seyreltilmesini hazırlamak için, 96 kuyucuklu bir plakanın B ila D sıralarında 180 mikrolitre bir X PBS doldurun. 200 mikrolitreye ayarlanmış çok kuyulu bir pipetleyici kullanarak, pipetleme ile solucan özetini yavaşça karıştırın. Maksimum sıvı miktarını, PBS içeren 96 kuyucuklu plakanın A sırasına aktarın.
Çok kanallı pipet kullanarak, üst sıradan 20 mikrolitreyi çıkarın ve B sırasına dağıtın. Mono kolonize solucanların bakteriyel nicelleştirilmesi için 1000 kat seyreltme elde etmek üzere B - C ve ardından satır C - D için bu adımı tekrarlayın. Katı agar plakaları üzerindeki her seyreltmenin 10 ila 20 mikrolitresini plakalayın.
Çok türlü kolonizasyon için, 10 santimetre agar plakaları üzerinde her seyreltmenin 100 mikrolitresini plakalayın. Bu protokol kullanılarak, soğuk felçli solucanların yüzey ağartılmasından sonra, tampondaki dış bakterilerin azalmasıyla görüldüğü gibi etkili dış sanitizasyon gözlenmiştir. Bağırsakla ilişkili bakterileri etkilemeden.
Solucanların manuel olarak bozulması daha heterojenliğe neden oldu. Silikon karbür kum, Tri Andex'li veya Tri Andex'siz bozulma için idealdi. 96 kuyu yönteminde, büyük cam boncuklar 96 kuyu tekniği için uygun değildi.
Küçük cam boncuklar tutarlı sonuçlar verdi, ancak boruyu ucunda tıkadı. Aynı bakteri havuzunda kolonize edilen solucanlar, bireysel bakteriler ve çok türlü bakteri toplulukları için gözlemlendiğinde bağırsak yükünde yüksek çeşitlilik göstermiştir. GFP'yi eksprese eden bakterilerle kolonize edilen solucanlar, bireysel solucan ölçümlerinde heterojenlik gösterdi.
Bu GFP için yabani tip Bristol Len iki solucanın kolonizasyonunu karşılaştıran bakteriyel suşu ifade eder. DAF'a göre iki IGF mutantı DAF 16 mutantının daha büyük bakteri popülasyonlarını desteklediğini, DAF ikisinin ise kolonizasyona dirençli olduğunu gösterdi. Bu heterojenlik, aynı deneyin farklı çalışmaları üzerinde karakteristik ve tutarlıydı.
Toplu özetleri simüle etmek için verilerin yeniden örneklenmesinin, tek tek solucan verilerine kıyasla dağılımı değiştirdiği bulunmuştur. Solucan başına parti ekstrapolasyonlu CFU, biyolojik varyasyon kaybına yol açan bireysel verilerin aritmetik ortalaması etrafında toplandı. Canlı yüzey ağartıcısını sindirmeye devam etmek ve solucanları durulamak yerine, daha ileri deneyler için kullanılabilir.
Solucanlar soğuktan çıkarıldıktan sonra hareket hızla devam edecektir.
