Bu protokol, sağlıkta ve hastalıkta her hücre tipi yanıtını karakterize eden hücreler arası kalsiyum sinyal paternini ortaya çıkarmaya izin verir. Bu teknik, karmaşık hücresel davranışın hızlı ve ayrıntılı biyofiziksel karakterizasyonunu sağlar. Bu IgG kaynaklı kalsiyum sinyalini nöroinflamatuar hastalıkların kişiselleştirilmiş tıbbı için parmak izi olarak kullanmayı planlıyoruz.
Gerçek hayat ortamında, tüm süreçleri ve olayları, özellikle mikroskop altında olanları görmek ve takip etmek kolay değildir. Bu nedenle, görsel veriler önemlidir. Bir ila üç günlük yavruların kafasını kestikten sonra, küçük açılı makas kullanarak cildi keserek kafatasını ortaya çıkarın.
Daha sonra foramen magnumunu yörüngelere doğru keserek kafatasını açın ve dik bir orta hat kesimi yapın. Beyni kafatasından çıkarın ve PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin. Her iki yarım küre arasındaki bağlantıları koparmak için forsepsin ucunu kullanın ve bir yarımküreyi merkezden yana doğru hafifçe iterek yarım küreleri kavisli forseps ile ayırın.
Meninksleri dikkatlice yırtarak çıkarmak için düz ve kavisli forseps kullanın. Daha sonra hipokampüsü kavisli forsepslerle sıkıştırarak çıkarın ve atın veya başka bir hücre kültürü hazırlığı için kullanın. Daha sonra, korteksi üç mililitre soğuk PBS içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve bir mililitrelik bir uçla 10 ila 15 kez yukarı ve aşağı pipet yaparak dokuyu homojenize edin.
Hücreleri beş dakika boyunca 500 g'da santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve bir mililitrelik bir uçla pipetleyerek peleti üç mililitre soğuk PBS'de yeniden askıya alın. Bir kez daha santrifüj yapın ve peleti% 10 FBS ve antibiyotiklerle desteklenmiş iki mililitre tam DMEM'de yeniden askıya alın.
Homojenatı iki mililitrelik bir tüpe aktardıktan sonra, homojenatı tek hücrelerin süspansiyonunu yapmak için 21 ve 23 gauge iğnelerden geçirin. Bir korteksten hazırlanan hücre süspansiyonunu, üç mililitre tam DMEM içeren 60 milimetrelik bir Petri kabına dökün ve Petri kabını hafifçe sallayın, böylece süspansiyon eşit olarak dağıtılır. Nemlendirilmiş bir inkübatördeki hücreleri, 37 santigrat derecede %5 karbondioksit ve %95 hava ile inkübe edin.
Astrosit büyümesini teşvik etmek için, eski ortamı çıkarın ve gevşek bir şekilde bağlanmış glial hücreleri ve FBS izlerini% 70 ila% 80 akıcılığa ulaştıklarında çıkarmak için hücreyi önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın. Daha sonra, bir mililitre önceden ısıtılmış tripsin çözeltisi ekleyerek altta yatan astrosit tabakasını tripsinize edin ve iki ila beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücrelerin ayrılmaya başlayıp başlamadığını kontrol etmek için bir mikroskop kullanın ve dört mililitre tam DMEM ekleyin.
Hücre süspansiyonunu toplayın ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra tüpü beş dakika boyunca 500 g'da santrifüj edin. Süpernatantı atın ve peleti bir mililitre tam ortamda yeniden askıya alın.
Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Ardından, kültür yemeğini hazırlayın ve kültür ortamı ekleyin. Hücreleri, beş mililitre taze tam DMEM'de santimetre kare başına 10 ila dördüncü hücre yoğunluğunda yeniden plakalayın ve her ortam değişiminden önce hücreleri tam DMEM ile yıkayın.
% 70 ila% 80 akıcılığa ulaştıktan sonra, tripsinizasyonu tekrarlayın ve yedi milimetrelik poli-L-lizin kaplı dairesel cam kapak kayması üzerine beş kez 10 ila üçüncü astrositleri tohumlayın. 10 dakika boyunca takmalarına izin verin ve tam DMEM ekleyin. Bunları 48 saat sonra deneylerde kullanın.
Mikroglial kültürleri hazırladıktan sonra, mikroglia'yı teşvik etmek için, glial hücrelerin akıcı hale gelmesine izin verin ve mikroglia 10 ila 15 gün sonra astrosit tabakasının üstünde görünecektir. Petri kabını yörüngesel bir çalkalayıcıda 220 RPM'de iki saat çalkalayın. Şimdi, ayrılan ve gevşek bir şekilde tutturulmuş hücreleri, süpernatantı bir mililitrelik pipet ucuyla aspire ederek hafifçe yıkayın.
Süpernatantı birkaç kez hücre tabakasına yavaşça dağıtın ve bu yıkama adımı sırasında tüm hücre tabakası yüzeyinin kaplanmasını sağlayın. Ortamı ayrılmış hücrelerle toplayın ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha önce gösterildiği gibi hücreleri merkeze alın, yeniden askıya alın ve sayın.
Yedi milimetrelik poli-L-lizin kaplı dairesel cam kapak kayması üzerinde beş kez 10 ila üçüncü mikroglia tohumlayın. 10 dakika boyunca takmalarına izin verin ve tam DMEM ekleyin. Bunları 48 saat sonra deneylerde kullanın.
DMEM'in tamamını yıkamak için, bir kapak kaymasını hücre dışı çözelti içeren bir kaba aktarın. Beş mikromolar'ın nihai konsantrasyonunu elde etmek için bir milimolar Fluo-4'yi hücre dışı çözelti ile seyrelterek boya yükleme çözeltisini hazırlayın. Kapak kaymasını karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca boya yükleme çözeltisindeki hücrelerle birlikte yerleştirin ve hücreleri 20 dakika boyunca hücre dışı çözelti içinde yıkayın.
Kapak kaymasını bir mililitre çalışma solüsyonu ile kayıt odasına yerleştirin. Deneme boyunca tutarlı sayıda hücreye sahip görüş alanını seçin. Görüntülemeye başlayın ve üç ila beş dakika boyunca bazal floresan seviyesini elde ederek taban çizgisini belirleyin.
Ardından çalışma çözümünün akışını durdurun ve istenen süre boyunca test çözümüne geçin. Her test çözeltisi arasında, hücreleri üç ila beş dakika boyunca çalışma çözeltisinin sabit bir akışıyla yıkayın. Çözeltinin üstünden sabit bir emme ayarlayarak kayıt odasındaki çözelti hacmini bir mililitrede tutun.
En yüksek sinyal yoğunluğu çerçevesini seçin ve Poligonal araç uygulamasını kullanarak bir hücreyi çevreleyin. Edinilen alandaki tüm hücreleri çevreledikten sonra, Daire aracını kullanarak arka planda beş ilgi alanı seçin. Ardından, tek bir hücrenin ortalama sinyal yoğunluğunu ve her zaman dilimi için arka planı ölçün.
İlgilendiğiniz tüm bölgeleri seçin ve ImageJ'deki ROI Manager'da Multi-Measure komutunu veya ticari yazılımlardaki eşdeğer bir komutu kullanın. Verileri MATLAB yazılımına aktardıktan sonra, ortalama beş arka plan yatırım getirisini elde edin ve her karenin ortalama arka planını aynı anda elde edilen karelerin ortalama yatırım getirisi yoğunluğundan çıkarın. Daha sonra, kalsiyum zirvesinin genliğini, kalsiyum geçicisinin entegre değişimini, zirveye ulaşma süresini, yükselme süresini, yarı genişliği ve sıklığı belirleyerek kalsiyum aktivitesini analiz edin.
GFAP, astrositleri görselleştirmek için ve Iba1 mikrogliayı görselleştirmek için kullanılır. hSOD1G93A astrositleri, ALS immünoglobulin G'ye, kalsiyum geçicisinin daha büyük genliği, daha önemli bir genel entegre değişim ve transgenik olmayan astrositlerden daha kısa bir zirve süresi ile yanıt verir. ALS immünoglobulin G'ye verilen yanıt, ATP'ye verilen yanıttan ayırt edilebilir.
hSOD1G93A astrositleri, depo tükenmesinin ortaya çıkardığı gibi depolarda daha yüksek bir kalsiyum iyonu seviyesine sahipti ve bu da bu iyonun aşırı yüklendiğini gösteriyordu. Mikroglia kültürlendi ve ortalama floresan yoğunluğu zamanla ekstrakte edildi. Üç hücrenin kalsiyum izleri, sadece bir hücrenin ALS immünoglobulin G'ye yanıt verdiğini, tüm hücrelerin ATP'ye yanıt verdiğini temsil ediyordu.
Sahte renkli görüntüler, ALS, IgG ve ATP'ye yanıt olarak floresan yoğunluğunu ve taban çizgisini temsil ediyordu. Hücrelerin yeterince yüklenmesi ve görüntüleme sisteminin parametrelerinin uygun şekilde ayarlanması gerekir, böylece sinyal deney sırasında ayrılmaz. Kalsiyum yayma ile birlikte, yama kelepçeleme yapılabilir.
Böylece, farklı membran iyon akımları ile kalsiyum yayan arasındaki korelasyonun daha eksiksiz bir resmi elde edilebilir. Hücre içi kalsiyum homeostazının anlaşılması, doğal olduğu kadar stresli ve dışsal uyaranlara verilen çeşitli yanıtların araştırılması için çok önemlidir.
