Nöromelanin Granüllerinin Proteomik Profilinin LC-MS/MS Analizi için Lazer Mikrodiseksiyon Tabanlı Protokol

Lazer mikro diseksiyon ve kütle spektrometresi kombinasyonumuz, her türlü dokuda proteomik düzeyde mekansal olarak çözülmüş değişikliklerin araştırılmasına izin verir. Bizim durumumuzda, nöromelanin granülleri. Protokolümüz, sınırlı numune malzemesine dayanan proteomik analize izin verir.

Bu genellikle postmortem beyin dokusu ile çalışırken büyük bir zorluktur. Proteomik düzeyde sağlıklı ve hastalık koşullarını karşılaştırmak için tek hücreler izole edilebildiğinden. Bu, hastalık mekanizmaları hakkındaki anlayışımızı geliştirebilir.

Başlamak için, doku zarı slaytını, doku yukarı bakacak şekilde robo aşamasındaki slayt tutucuya yerleştirin. Doku bölümünün genel bir taramasını elde etmek. Tarama işlevini kullanın, sol üst ve sağ alt köşelerden ilgi alanını seçin.

Ardından, taramayı gerçekleştirmek için Tüm YG'leri tara'yı seçin. Mevcut görüş alanında nöromelanin granüllerinin otomatik seçimi için. Görüş alanı analizini seçin.

Ardından sonucu tersine çevir'i seçin ve RGB kanalları için eşiği ayarlayın. Böylece önizleme penceresinde yalnızca nöromelanin granülleri kırmızı renkle vurgulanır. Şimdi görünüm alanı için ayarlanan ayarları kullanmak için Tamam'a tıklayın.

Lazer ayarlarını, slaytın yalnızca membranla kaplı bir alanını kullanarak yapın. Numune toplama tüpü kapağını 50 mikrolitre ultra saf su ile doldurun. Ve kapağı robo taşıyıcının toplayıcısına yerleştirin.

Yazılım arayüzünü kullanarak, örnek toplamayı başlatmak için robo taşıyıcıyı robo ikinci aşamanın üzerine yerleştirin. Lazeri başlatın. Lazer işlemi sırasında enerji ve odak ayarlarını kontrol edin ve gerekirse ayarları yapın.

İzole edilen nesnelerin en az ilk 10 nesne için numune toplama tüpü kapağına uygun şekilde yalıtıldığından ve mancınıkla fırlatıldığından emin olun. Numune alma işlemi tamamlandığında, robo hareket ettiriciyi başlangıç konumuna getirin ve numune toplama tüpünü çıkarın. Numuneleri merkezleme ile döndürdükten sonra.

Numuneleri vakum konsantratöründe 1,5 saat kurutun. Metinde açıklandığı gibi triptik sindirim gerçekleştirdikten sonra. 200 ila 400 nanogram numune peptidini% 0.1 TFA'lık tanımlanmış bir hacimde çözerek numuneyi HPLC-MS analizi için hazırlayın.

İnert kütleli spektrometrik cam şişe girişlerinde. Düşük numune miktarı nedeniyle konsantrasyon tayini uygulanamıyorsa. Toplam iyon akımını karşılaştırarak aynı numune yüklemesini doğrulayın.

Proteomik ham veri analizine başlamak için. Ham dosyaları yazılıma yüklemek için yükle'ye tıklayın. Örnek adları atamak için set denemesini tıklayın.

Gruba özgü parametreleri tanımlamak için. Değişken modifikasyonlar olarak deamidasyon NQ, oksidasyon M ve karbamidometilasyon N-terimini seçerek modifikasyonları ekleyin. ve sonra sabit modifikasyon olarak karbamidometilasyon C ekleyin.

Sindirim sekmesinde sindirim enzimi olarak tripsin seçin. Etiketsiz niceleme sekmesinde, LFQ seçeneğini ekleyin ve 10'dan fazla dosya işlenecekse, işlem süresini kısaltmak için hızlı LFQ seçeneğini belirleyin. Diğer tüm gruba özgü parametrelerin fabrika ayarlarında kalmasını sağlama.

Genel parametreler sekmesine ilerleyin ve uniprot'tan türetilen FASTA dosyasını ekleyin. org, diziler sekmesinde. Tanımlayıcı kuralı uygun şekilde değiştirin.

Ve Homo sapiens için taksonomi kimliği 9606'yı ekleyin. Protein niceliği için benzersiz ve jilet peptitleri seçin. Ardından, etiketsiz niceleme sekmesinde protein niceliği için bir ölçüt olarak iBAQ seçeneğini ekleyin.

Diğer tüm global parametrelerin fabrika ayarlarında kaldığından emin olun ve başlat'a tıklayın. Analiz başarıyla yapıldıktan sonra protein gruplarını geri alın. txt çıktısı.

Protein gruplarını yükleyin. txt dosyası analiz yazılımındadır. iBAQ değerlerini ana sütunlar olarak ekleyin ve diğer tüm sütunları türlerine göre sıralayın.

Satırları kategorik sütuna göre filtreleyerek tuzakları ve kirleticileri filtreleyin ve sonuçları geçerli değerlere göre filtreleyin. Daha fazla işlem için çıktıyı txt biçiminde dışa aktarın. Ve araştırma sorusu ile ilgili sonuçları değerlendirir.

Bu çalışmada, NMG'lerde 1.898 protein grubu ve 1.565'i her iki doku bölgesinde 1.384'ü tanımlanmış olan çevredeki SN dokusunda tanımlanmıştır. Böylece 514 ve 181 protein grubu sırasıyla NMG'lerde ve SN dokusunda spesifik olarak tanımlanmıştır. Temsili DDA ölçümlerinde.

NMG'lerde SN'ye kıyasla biraz daha yüksek iBAQ değerleri, NMG'lerde protein sitoplazmik dinien-1, ağır zincir 1'in daha yüksek bir bolluğunu göstermiştir. Bu gözlem, peptid ESPEVLLTLDILK için PRM deneylerinde doğrulanabilir. NMG'lerde daha yüksek bir bolluk tespit edildi.

MS1 ve MS2 düzeyindeki en yoğun alanı temel alır. En önemli adım, NMG'lerin izolasyonudur, çünkü protokolün geri kalanı bu adımın düzgün bir şekilde gerçekleştirilmesine dayanmaktadır. LMD prosedüründen sonra, örnekler genomik, transkriptomik, proteomik veya lipidomik gibi her türlü omik teknik için kullanılabilir ve daha ileri işlemler yapılabilir.