Burada önerdiğimiz teknik, bitişik dokulara verilen hasarı azaltarak ve deneyimsiz operatörler için bile tekrarlanabilirliği artırarak manuel lezyon protokollerinin sınırlamalarının üstesinden gelmemizi sağlar. Bu teknik, hedeflenen bir UV lazerle birleştirilmiş dönen cam kılcal damar sayesinde çevre dokulara zarar vermeden lezyonun tam olarak nerede indükleneceğini seçmemizi sağlar. VAST ekipmanının çalıştırılmasında birçok adım söz konusudur, bu nedenle her şeyin doğru yapıldığından emin olmak için her adımı işaretlemenizi tavsiye ederim.
Larvaları anestezi içeren ortamı kullanarak anestezi yaparak başlayın ve daha sonra bunları kuyucuk başına 300 mikrolitre ortam içeren 96 delikli bir plakaya aktarın. Ablasyon için lazer de dahil olmak üzere tüm sistem bileşenlerini açın. Ardından, otomatik zebra balığı görüntülemeyi veya VAST yazılımını başlatın, ilk pencerede Plaka'yı seçin ve Bitti düğmesine tıklayın.
Kılcal damarın boş ve temiz olup olmadığını soran küçük bir pencere açılacaktır. İçerideki hava kabarcıkları için kılcal damarın görüntüsünü kontrol edin. İçinde hava kabarcığı yoksa, açılan pencerede Evet'e tıklayın.
LP Örnekleyici penceresinde, Dosya menüsüne gidin ve Komut dosyasını aç seçeneğini belirleyin. Gerçekleştirilecek denemeye karşılık gelen komut dosyasını içeren bir dosya seçin. Ardından, ana VAST yazılım penceresinde Dosya'ya gidin ve Denemeyi aç'ı seçin.
Planlanan denemeye karşılık gelen deneme dosyasını seçin. ImageJ/Fiji yazılımını başlatın, Dosya menüsüne gidin ve komut dosyası penceresini açmak için Yeni komut dosyası'nı seçin. Ardından, Dosya menüsüne gidin ve lazer lezyon betiğini yüklemek için Aç'ı seçin.
Ardından, Python IDE'yi başlatmak için Dosya menüsüne gidin ve lazeri yönetmek üzere komut dosyasını yüklemek için Dosya aç'ı seçin. Ardından, Çalıştır menüsüne tıklayın ve komut dosyasını çalıştırmak için Hata Ayıklamadan Çalıştır'ı seçin. Lazer zayıflatıcı başlatılırken terminal panelindeki bir dizi mesajın bir miktar gürültüyle birlikte göründüğünden emin olun.
VAST yazılımının ana penceresinde, sahneyi hareket ettirmek ve kılcal damarı mikroskop hedefine göre ortalamak için ok düğmelerine tıklayın. Göz merceklerine bakın ve mikroskopun iletilen ışığını kullanarak kılcal damarın tepesine odaklanın. LP numune alma cihazının sol plaka tutucusuna larvaları içeren 96 delikli bir plaka yerleştirin.
Ardından, numune alma cihazının sağ plaka tutucusuna toplama için başka bir plaka yerleştirin. Plakanın A1 kuyucuğunun tutucunun sol ön köşesinde olduğundan emin olun. VAST yazılımının LP Örnekleyici penceresinde, Plaka şablonu düğmesine tıklayın ve larva içeren tüm kuyucukları seçin.
Pencereyi doğrulamak ve kapatmak için Tamam düğmesine tıklayın. Ardından, larvaları yüklemeye başlamak için LP Örnekleyici penceresindeki Plakayı çalıştır düğmesine tıklayın. Ardından, mikroskop yazılımına gidin ve larvaları görüntülemek için Canlı düğmesine tıklayın.
Mikroskop odak düğmesini, omurilik merkezi kanalı görünene kadar açın. Floresan ile anlık görüntü alın ve görüntüyü bir klasöre kaydedin. Görüntüyü ImageJ'de açın ve gerekirse kontrastı ayarlayın.
İlgi alanı çizgi aracına tıklayın ve omuriliğe ortalanmış kısa bir çizgi çizin. Mikroskobu %100 yansıtıcı ayna konumuna getirin. ImageJ komut dosyasını yükleyin ve Tekrarlama'yı 2, Örnek'i 1, Genişlik'i 40 mikrona ve Zayıflamayı 89'a ayarlayın.
Tüm parametreleri ayarladıktan sonra, Tamam düğmesine tıklayın. Lazer çekim sırası tamamlandığında, görüntüleme yazılımında floresan görüntülemeye geçin ve odağı ayarlayın. Yeni bir anlık görüntü alın ve kaydedin.
Bu yeni görüntüyü ImageJ'de açın ve omuriliğin kendisinden daha büyük yeni bir çizgi çizin. Mikroskobu %100 yansıtıcı ayna konumuna getirin. ImageJ komut dosyası penceresine gidin ve Tekrarlama'yı 2, Örnek'i 1, Genişlik'i 40 mikrona ve Zayıflamayı 89'a ayarlayın.
Tüm parametreleri ayarladıktan sonra, Tamam düğmesine tıklayın. Lazer atış sırası bittiğinde, floresan görüntüleme ve odaklama ile transeksiyon kalitesini doğrulayın. Lezyon bölgesinde hiçbir hücrenin veya aksonun bozulmadan kalmadığından emin olun.
Ana VAST yazılım penceresine gidin ve lezyonlu larvaları boş 96 delikli plakaya toplamak için Topla düğmesine tıklayın. Ardından, VAST sistem ışığını tekrar açmak için onay kutusu tepsisi ışığını tıklayın. Larvaları 96 kuyucuklu plakadan mümkün olan en kısa sürede çıkarın ve larvaların lezyon sonrası iyileşmesi için tatlı balık suyu ile temiz bir Petri kabına aktarın.
Petri kabını 28 santigrat derecede bir inkübatöre koyun. Asetillenmiş tübülin immüno-boyaması ve kalsiyum görüntüleme, lazer lezyonunun omurilik dokusunun devamlılığını tamamen bozduğunu göstermektedir. Bu resimde sağlam bir omurilik gösterilmiştir.
Aksonların lezyonun kaudal ve rostral tarafları arasındaki tam bir bozulması, omuriliğin tam transeksiyonunu doğrular. Tamamlanmamış transeksiyonun bir örneği burada gösterilmiştir. NBTG cAMP 6-S larva üzerindeki transekte omurilik bu resimde gösterilmiştir.
Dikdörtgenler, lezyonların rostral ve kaudal taraflarındaki floresan yoğunluğunu ölçmek için kullanılan ROI'leri göstermektedir. Grafik görüntü, rostral ve kaudal analiz ROI'lerinde zaman içinde floresan yoğunluğu değişimini temsil eder. Bir NBT:dsRed larvasının lazer lezyonundan önce, lazer lezyonundan üç saat, 24 saat ve 48 saat sonra maksimum yoğunluk projeksiyon floresan görüntüleri burada gösterilmiştir.
Yaralanmadan 24 saat sonra, yaralar kapanmaya başladı ve 48 saat sonra omuriliğin ilk yapısının kısmen restorasyonuna yol açtı. Kalsiyum görüntüleme kullanılarak yaralanmadan 48 saat sonra kısmi fonksiyonel bir yeniden bağlantı doğrulandı. Kaudal bölgedeki sivri uçların genliği ile rostral alan arasındaki oran, yaralanma sonrası 3, 24 ve 48 saat arasında bir artış göstermiştir.
NBT:dsRed mpeg1 GFP larva lazer lezyonları kullanılarak lazer lezyonlarından sonra makrofaj alımı gözlendi. Etiketli hücre sayısında manuel ve lazer lezyonları arasında fark gözlenmedi. Lezyonsuz balıklar, her iki lezyon koşulunda da lezyonlu balıklardan daha az çift etiketli hücre gösterdi.
Lazer lezyonu manuel lezyona göre daha az kas ve deri hasarına neden olur. Lezyonun tam olup olmadığını doğrulamak çok önemlidir. Lezyon bölgesinde sağlam bir hücre veya yapı görünmemelidir, sadece loş bir arka plan görülmelidir.
Omurilik rejenerasyonunu incelemek için, immüno-histokimya ve kalsiyum görüntüleme dahil olmak üzere birçok yöntem kullanıyoruz. Önemli olarak, manuel lezyonlu hayvanların aksine, doku diseksiyona dayanabileceğinden, elektrofizyoloji de yapabiliriz. Bu yeni teknik, tekrarlanabilir ve kontrollü lezyonlara izin vererek yaralanma sonrası omurilikteki yapısal ve fonksiyonel doku organizasyonunu nicel olarak incelememizi sağlar.
