Bu yöntem önemlidir, çünkü hasta kaynaklı organoidler, bu çok spektrumlu hastalığın genetik ve fenotipik heterojenliğini sıklıkla taklit ettikleri için ürolojik kanserleri incelemek için hızlı ve güçlü bir araç sağlarlar. Organoidler sınırlı miktarda hasta biyopsi materyalinden izole edilebilir ve aşağı akış analizi için hızla genişletilebilir. Bu protokol kullanılarak üretilen organoidler, hem ürolojik kanserlerin hücresel ve moleküler temelini anlamamıza yardımcı olacak modeller olarak hem de kanserin hangi tedavilere ve bireysel hastalara yanıt verebileceğini tahmin etmemizi sağlayan hassas tıp araçları olarak kullanılabilir.
Başlamak için, ameliyattan taze bir makroskopik olarak uygulanabilir tümör örneği toplayın ve numunenin taşıma sırasında steril bir 50 mililitrelik konik tüp veya idrar örneği kavanozunda taşıma ortamına batırıldığından emin olun. Doku ağırlığı, numune açıklaması ve hasta numune işleme sayfasındaki kan ve idrar örnekleriyle ilgili ayrıntılar dahil olmak üzere numune ayrıntılarını kaydedin. Taşıma ortamını dikkatlice 10 mililitre bazal medya ile değiştirin ve tümör dokusunun yerçekimi ile yerleşmesine izin verin.
Daha sonra, forseps kullanarak, tümör dokusunu çıkarın ve steril bir 90 milimetre Petri kabına yerleştirin. Dokunun ağırlığını klinik numune işleme sayfasına ve diseksiyon ızgarasına gram veya miligram olarak kaydedin. Daha sonra bir neşter sapına monte edilmiş tek kullanımlık bir neşter bıçağında steril forseps kullanarak, kanserli olmayan dokuyu ve makroskopik olarak görülebilen nekrotik bölgeleri çıkarın.
Tümör parçalarını bir veya iki kez soğuk DPBS ile yıkayın, ardından bunları toplayın ve yeni bir steril 90 milimetre Petri kabına aktarın. Bir fotoğraf çekin, bir doku diyagramı çizin ve doku diseksiyonunu klinik bir işlem ızgarasında planlayın. Histopatolojik analiz için, tümör dokusunun yaklaşık 50 miligramını etiketli tek kullanımlık plastik histoloji kasetine yerleştirin.
Daha sonra histoloji kasetini 5X ila 10X hacimli% 10 nötr tamponlu formalin içeren bir kaba batırın ve gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, formalini, doku işlenene kadar dört santigrat derecede saklamak için% 70 etanol ile değiştirin. Moleküler analiz için, sıvı azot kullanarak bir RNaz, DNaz içermeyen 1.5 mililitre kriyovyal içinde en az bir tümör parçasını dondurun ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Daha sonra, kalan tümör parçalarını içeren 90 milimetrelik Petri kabına beş mililitre organoid ortam dağıtın ve dokuyu mekanik olarak mümkün olduğunca ince kesin. steril bir 10 numaralı neşter bıçağı kullanarak. İnce kıyılmış dokuyu 50 mililitrelik bir konik tüpe aktarın ve hücre kümelenmesini önlemek için dört mililitre organoid ortam, bir mililitre 10X kollajenaz / hyaluronidaz ve mililitre DNaz I başına 0.1 miligram ekleyin.
Kıyılmış tümör dokusunu enzim çözeltisi içinde bir ila iki saat boyunca bir orbital çalkalayıcı veya bir inkübatördeki rotatörde bir hücre süspansiyonuna ayırmak ve kollajenleri parçalamak için inkübe edin. Ardından, numuneye bazal ortamın hacminin iki katını ekleyerek sindirimi durdurun. Numuneyi santrifüj edin, aspire edin ve süpernatanı atın.
Daha sonra, kirletici kırmızı kan hücrelerini lize etmek için, peleti beş mililitre amonyum klorür potasyum tamponunda yeniden askıya alın ve tüpü oda sıcaklığında üç dakika boyunca veya kırmızı kan hücrelerinin tamamen lizisi görülene kadar inkübe edin. Daha sonra tüpe 20 mililitre bazal ortam ekleyin. Tekrar santrifüj yapın ve süpernatanı aspire edin.
Bu adımda, ısınmak için 37 santigrat derecelik bir su banyosuna 10 mililitrelik 2X ve 1X organoid ortamlı bir aliquot yerleştirin. Büyük çözünmez malzemeyi çıkarmak için numuneyi önce önceden ıslatılmış tersinir 100 mikronluk bir süzgeçten 50 mililitrelik yeni bir tüpe filtreleyin. Daha sonra, tek hücre ve bağışıklık hücresi izolasyonu için küçük kümelerde tek hücreleri toplamak için ıslaklık öncesi geri dönüşümlü 37 mikronluk bir süzgeçten süzün içinden süzün.
Ardından, 37 mikron süzgeci tersine çevirin ve küçük ve orta büyüklükteki kümeleri toplamak için 10 mililitre bazal ortam ekleyin. Bu yeni 50 mililitrelik tüplerin her birini DPBS ile 40 mililitreye kadar doldurun, ardından süspansiyonu santrifüj edin ve süpernatanı atın. Daha sonra, tek hücreleri içeren tüpe 10 mililitre bazal ortam ekleyin ve otomatik bir hücre sayacında tripan mavisi dışlama boyası kullanarak hücreleri sayın.
Hücre sayısını ve hücrelerin yaşayabilirliğini belirleyin. Kalan numuneyi santrifüj edin ve ortamı% 10 fetal sığır serumu% 1 penisilin ve streptomisin ve% 10 DMSO içeren hücre dondurma çözeltisi veyasıyla,% 10 DMSO ile değiştirin, ardından örnekleri 1.5 mililitrelik kriyovyallere yerleştirin, kendi kendine dondurucu bir kapta saklayın ve kapları hemen eksi 80 santigrat derece dondurucuya aktarın. Ertesi gün, kriyovalleri uzun süreli depolama için kriyojenik sıvıya veya hava fazı depolamasına aktarın.
Daha sonra, toplanan küçük ve orta büyüklükteki kümeleri 500 mikrolitre önceden ısıtılmış 2X organoid ortam ile yeniden askıya alın. Daha sonra buz gibi soğuk P-1000 steril filtre pipet uçları ile hücrelere BME ekleyin ve nazikçe karıştırın. Yeniden yapılandırılmış hücrelerin 100 mikrolitresini BME karışımını ultra düşük bir ataşman, düz tabanlı 96 delikli plakanın kuyularına hızlı ve dikkatli bir şekilde pipetleyin ve plakayı katılaşması için 20 ila 30 dakika boyunca bir inkübatöre yerleştirin.
Kuluçkadan sonra, ampirik olarak değerlendirilen hacme bağlı olarak BME hücre süspansiyonunun üzerine bir ila iki oranında organoid ortam ekleyin ve dengelenmek için plakayı 20 dakika boyunca bir inkübatöre yerleştirin. Kuluçkadan sonra, plakayı inkübatörden çıkarın ve organoidleri faz kontrastı veya parlak alan ayarları altında görsel olarak değerlendirmek için mikroskop aşamasındaki bir numune tutucuya monte edin. Tükenmiş büyüme faktörlerini ve genel hacmi yenilemek için 50 mikrolitre önceden ısıtılmış organoid ortam kullanarak ortamı her iki ila üç günde bir doldurun.
Geçiş yapmadan önce 1, 2 ve 3. ve 5, 7 ve 10. günlerde hızlandırılmış seri görüntülerini alın. Mesane kanseri dokusunun ticari olarak temin edilebilen kollajenaz / hyaluronidaz ve DNaz I ile iki saatlik sindirimi, lamina propria içindeki neoplastik hücreler ve mesanenin kas katmanları da dahil olmak üzere 0.5 ila 1 milimetreküp daha karmaşık sistektomi biyopsi dokusunun yeterli sindirimine yol açar. Daha büyük sindirim sonrası fragmanlar, yeni iki boyutlu kültürleri izole etmek için her boyuttaki kültür ve standart doku kültürü plakaları için uygundur.
Bu prosedür tarafından üretilen organoidler, toplama, sıkıştırma ve sıkı hücresel yapıların son oluşumu aşamaları dahil olmak üzere dinamik kendi kendine montaja tabi tutulur. Histolojik olarak bu yapılar orijinal hasta tümörünü özetler. Bu prosedürde üretilen organoidler, daha fazla histopatolojik karakterizasyon, biyobankacılık ve ilaç etkinliği testi dahil olmak üzere birçok amaç için uygundur.
Organoidlerin neslini takiben, anti-kanser tedavilerinin rolü, metabolik profilleme veya transkripsiyon profillemesi dahil olmak üzere bu tümörlerin profilini çıkarmak için ek yöntemler kullanılabilir. Bu 3D çerçevesinde, bu ek metodolojiler mesane kanseri biyolojisine güçlü bir bakış açısı sağlar. Bu yöntem, immünoonkoloji ve hücresel metabolizmayı araştıran çalışmalar için önemli bir temel oluşturmuştur.
