Bu protokol, CRISPR/Cas9 teknolojisi tarafından üretilen mutantları çok sayıda kişiden tespit etmenin çok basit ve verimli bir yoludur. Bu tekniğin iki temel avantajı, birkaç saat içinde yapılabilmesi ve çok sayıda organizma için uygulanabilir olmasıdır. Astar tasarımı belirli genler için zorlu olabilir ve HRMA'yı verimli hale getirmek için birden fazla astar tasarımı ve doğrulaması gerekebilir.
Degrade PCR gerçekleştirmek için ana karışım hazırlayarak başlayın. Ardından şablon olmayan kontrol veya NTC için 19 mikrolitre ana karışımı 96 kuyulu bir plakada çıkarın. Ardından, şablonu kalan ana karışıma ekleyin.
Aliquot 20 mikrolitre numune karışımı 96 kuyu plakasına. Bisiklet parametrelerini izleyerek PCR yapın ve daha sonra yazıda belirtilen parametreleri kullanarak termal eriyik profillerini oluşturun. Gerekli tüm malzemeleri topladıktan sonra, genotiplenecek kişi başına 0,5 mikrolitre DNA salınım reaktifi ve 20 mikrolitre seyreltme tamponu ile bir ana karışım hazırlayın.
Çok kanallı bir pipet kullanarak, karışımın 20 mikrolitresini bir PCR plakasına aliquotlayın ve PCR plakasını buz üzerinde bırakın. Daha sonra, uyuşturulmuş G1 sivrisineklerini sakinleştirmek için cam bir Petri kabına yerleştirin ve ikinci Petri kabına sekiz vahşi tip sivrisinek yerleştirin. Bir çift cımbızı% 70 etanol ile silin ve sivrisineklerin arka ayaklarından birini çıkarmak için dezenfekte edilmiş cımbızı kullanın.
Daha sonra bacağı DNA salınım reaktif çözeltisine batırın. Sivrisinekleri ilgili şişeye yerleştirin ve şişeyi bir süngerle kapatın. Tamamlandığında, bacağı bir sonraki sivrisinekten çıkarmadan önce 96 kuyu plakası tamamlanana kadar cımbızı% 70 etanol ile silin.
Daha sonra, plakayı optik bir PCR plaka contası ile kapatın ve bacakları oda sıcaklığında içeren PCR plakasını iki ila beş dakika kuluçkaya yatırın, ardından iki dakika boyunca 98 santigrat derecede inkübasyon yapın. Plakanın oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. PCR için, tercih edilen bileşenleri içeren bir ana karışım hazırlayın ve ardından 19 mikrolitre ana karışımı 96 kuyu plakasının her kuyusuna aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın.
Daha önce hazırlanmış sivrisinek DNA'sını içeren DNA salınım çözeltisinin bir mikroliterini plakaya aktardıktan sonra, plakayı optik bir PCR plaka contası ile kapatın. El yazmasında açıklanan parametreleri izleyerek termal eriyik profilleri oluşturmak için PCR'yi uygun döngü parametreleriyle gerçekleştirin, ardından referans kümesine vahşi tip kontrol atayarak erime profillerini inceleyin. Farklı kümeleri 96 kuyu şablonunda karşılık gelen renklerle işaretleyin.
Daha sonra, ilgi kıvrımları olan bireyleri seçin ve seçilen bireyleri tüplerden arka çapraza çıkarın. Kan besleme dişi yaptı, ardından G2As toplamak. Temsili analizde, Aedes aegypti'nin ZIP11 mutantının sıra analizi gösterilmiştir.
Aedes aegypti ZIP11 heterozid mutantlarından alınan elektroferogram, indelin meydana geldiği nükleotid pozisyonunu gösteriyordu. Çok biçimli pozisyonlar her iki nükleotidleri de eşlik ettiği için indel, tekten çift tepeye bir kayma ile temsil edilir. Çalıştırmanın sonunda, silinen veya eklenen temel çiftlerin sayısı tek tepeler sayılarak hesaplandı.
Aedes aegypti ZIP11 ve myo-fem genlerinde mutasyonlar içeren sivrisinekler genotiplendi ve HRMA'nın yüksek çözünürlüklü eriyik analizi kullanılarak sıralandı. Örneklerin floresan sinyalleri bir ila sıfır arasında göreceli değerlere normalleştirildi. Ayrıca, her eğri vahşi tür başvurusundan çıkarılır ve karşılık gelen büyütmeyi gösterilir.
Gruplar arasında uygun bir ayrımın yapılmadığı temsili sonuçlarda başarısız bir otomatik küme ataması gösterilir. Ayrıca, her örnek ayrı ayrı analiz edildi ve heterozozygotlar, homozigotlar ve transheterozigotların referans örneklerine benzerlik esas alınarak doğru gruplara atandı. HRMA'ları gerçekleştirdikten sonra, mutasyona uğramış bireylerden DNA'nın sıraya konması, indelleri analiz etmek ve hedeflenen dizideki diğer mutasyonları tanımlamak için gereklidir.
