Bu protokol, kırınım sınırını atlamak ve EV'leri üç boyutta nanometre hassasiyetiyle görselleştirmek için dSTORM olarak da bilinen stochastic optik rekonstrüksiyon mikroskopisini özellikle doğrudan doğrudan kullanır. dSTORM'un önemli bir avantajı, EV'nin biyokimyasal doğasını değiştiren adımlara zarar vermeden ışığın kırınım seviyesinin altındaki parçacıkları doğrudan görselleştirme yeteneğidir. Evrimsel olarak farklı birçok virüs EV sinyali verir, bu nedenle dSTORM, hastalık biyobelirteçleri ve ilerlemesi için EV'leri karakterize etmek ve SARS-CoV2 gibi bireysel virüs parçacıklarını görselleştirmek için kullanılabilir. Benzeşimli, hücre dışı veziküller veya EV'leri cam tabanlı, mikroslid, sekiz kuyulu plakalara toplam 200 mikrolitre hacimde yerleştirerek başlayın ve dört santigrat derecede bir gecede yüzeye yapışmalarını sağlar.
Mevcut çözeltiyi sekiz kuyulu plakadan çıkarmadan, her kuyudaki EV içeren çözeltiye 1X PBS'de %4 paraformaldehitten oluşan 200 mikrolitre ekleyerek EV'leri plakalara sabitleyin ve plakaların oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatmasını bekleyin. EV'leri rahatsız etmemek için paraformaldehit ve fazla çözeltiyi bir mikropipette dikkatlice çıkarın. Fazla paraformaldehit gidermek için EV'yi 1X PBS ile yıkayın.
Yıkama prosedürünü üç kez gerçekleştirin. Fazla 1X PBS'yi çıkarın. Üreticinin protokolüne göre görüntüleme tamponunda seyreltilmiş beş milimolar protocatechuic dioksijenaz çözeltisi oluşturarak numune başına 250 mikrolitre dSTORM Bcubed tampon çözeltisi hazırlayın.
Üretici protokolüne göre her birine 250 mikrolitre hazırlanan tamponu ekleyin ve oksitleyici molekülleri çöpe atmadan önce plakaları oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya bırakın. EV'ler hemen görselleştirilebilir veya bir hafta boyunca dört santigrat derecede saklanabilir. Süper çözünürlüklü mikroskobun kalibrasyonu için gerekli boncukları hazırlamak için, 100 nanometre mikrokürecikleri moleküler biyoloji sınıfı suda% 0,5 konsantrasyonda seyreltin ve pipet 200 mikrolitreyi cam tabanlı, mikroslid, sekiz kuyulu bir plakanın her kuyusuna seyreltin.
Boncukların oda sıcaklığında bir saat boyunca kuyulara yerleşmesine izin verin. Mevcut çözeltiyi çıkarmadan, kalibrasyon boncuk çözeltisine her kuyuya PBS'de% 4 paraformaldehit 200 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatmaya izin verin. Boncukları rahatsız etmemek için paraformaldehiti bir mikropipetle dikkatlice çıkarın ve boncukları 1X PBS ile üç kez yıkayın.
Arabelleği yazıda açıklandığı gibi hazırlayın. 1X PBS'yi çıkarın ve hazırlanan tamponun her kuyuya 250 mikrolitresini ekleyin. Arabelleğin görselleştirmeden önce 20 dakika oturmasına izin verin.
Sahne alanına herhangi bir şey yerleştirmeden önce 3B mikroskoplara bağlanmak için Mikroskobu Bağla düğmesini kullanın. Hedefe 100X yağ ekleyin ve kuyunun merkezini hedefin üzerine yerleştirin. Edin ayarında, 473 ve 640 nanometrelik heyecan lazerlerini açın ve Görüntüle'ye tıklayın.
3D lensi etkinleştirmeden, Görüntü Görüntüleme Seçenekleri'ndeki Foton sayılarına tıklayarak foton doygunluğu ayarının altındaki boncukları görüntüleyin. İlk lazer güçlerini 473 nanometre lazer için 8,4 miliwatt ve 640 nanometre lazer için 11,6 miliwatt olarak ayarlayın. Lazerin odağını eksi 300 nanometreye veya kalibrasyon boncuklarının odak düzlemine düşürerek tek tek boncukların net bir çözünürlüğünü üretin.
Z düzlemi odaklandıktan sonra, lazer güç seviyelerini her görüş alanındaki varyasyonu hesaba katacak şekilde daha fazla ayarlayın. Cihaz işlevleri altında, X, Y ve Z eksenindeki hataları elde etmek için 3B haritalama kalibrasyonunu ve kanal eşleme kalibrasyonunu tamamlayın. kanal eşleme kalibrasyonu sırasında en fazla görüş alanı sayısını 20'ye, hedef nokta sayısını 4.000'e, kanallar arasındaki maksimum mesafeyi 5,0 piksele ve kanallar arasındaki dışlama yarıçapını 10,0 piksel olarak ayarlayın.
Kalibrasyonun %90'dan daha yüksek bir nokta kapsama alanı ve iyi bir haritalama kalitesi ürettiğinden emin olun. Verilen kalibrasyon verilerini gelecekteki görüntü alımları için kaydedin. Hedefe 100X yağ ekleyin ve hazırlanan EV'leri mikroskopa yerleştirin.
3D lensi etkinleştirmeden, 640 nanometrelik ekscitasyon lazerini açın ve kırmızı membran, interkalasyon, boya lekeli EV'leri heyecanlandırmak için görüş alanındaki sinyalin yoğunluğuna bağlı olarak başlangıçta 1,2 ila 12,5 miliwatt'a yükseltin. Görüntü Görüntüleme Seçenekleri'nin altında, EV'leri daha iyi görselleştirmek için görüntüleme yöntemini foton doygunluğundan yüzdelik dilimlere geçirin. Sinyali en üst düzeye çıkarırken gürültüyü en aza indirmek için lazer gücünü ayarlayın ve diğer tüm parametreleri koruyun.
Z eksenindeki yukarı veya aşağı simgesini tıklatarak Z düzleminin odağını ayarlayın. Pozlama süresini 20 milisaniye, kare yakalamayı 10.000 kareye ve ilk lazer gücünü sinyalin yoğunluğuna ve görüş alanına bağlı olarak 1,2 ila 12,5 miliwatt arasında ayarlayın. Simgeyi kullanarak 3D lensi etkinleştirin ve Edin düğmesine tıklayarak satın almayı başlatın.
Görüntü alma işlemi boyunca lazer gücünü her 1000 karede üç artışla veya yüksek sinyal-gürültü oranını korumak için yeterli artırarak artırın. Satın alma sırasında Z düzlemini ayarlamayın. Görüntü alımından sonra, Görüntülemeyi çözümle penceresine geçiş yapma.
Filtrelenmemiş görüntüde sürüklenme düzeltmesi gerçekleştirin ve filtreleri etkinleştirin. Yazıda belirtildiği gibi foton sayısını, yerelleştirme hassasiyetini, sigmaları ve çerçeve dizinini ayarlayın. Tek tek EV'lerin X ekseni boyunca bir X, Y, Z düzlemi görüntüleme aracını görüntüleme alanından kaplayın ve fotoğraf çekme olaylarının tek tek csv dosyalarını dışa aktarın.
Fotoğraf çekme olaylarını ayarlanan mesafe gruplarına sabitleyen bir Çizgi Histogram aracı kullanarak X üzerindeki tek tek EV'leri, X x Y görüş alanındaki Y eksenini ikiye ayırın. Tek EV'lerin görüntülerini alın ve bunları tif dosyaları olarak kaydedin. Z ekseni boyunca yerleşime göre bir 3B görselleştirme aracı ve rengi kullanarak tek tek EV'lerin 3B videolarını oluşturun.
X, Y ekseninde ortalama 16 nanometre ve Z ekseninde 38 nanometre hata üreten mikroskobun kalibrasyonunun ardından, saflaştırılmış u20'ler EV'ler X, Y ekseninde 20 nanometreye kadar çözünürlük ve Z ekseni boyunca 50 nanometre ile başarıyla görselleştirildi. Lazer gücü arttıkça 10.000 kare pozlama boyunca 3D fotoğraflarda dSTORM aracılığıyla görselleştirilen bireysel EV'ler, elde edilen görüntüde kolayca belirgindi. Z düzleminde alım sonrası görüntü düzeltmesi, foton sayıları, sigmalar ve yeniden yapılanan görüntünün yerelleştirme hassasiyeti, EV'nin 3D olarak net bir şekilde çözülmesine neden oldu.
EV fotoğrafları, sağ üst köşedeki gösterge tarafından görüldüğü gibi, yalnızca ilk 7.000 kare sırasında yeniden görüntülendi. Histogram, fotoğraf çekme olaylarının çoğunun 100 nanometre yarıçapında gerçekleştiğini doğrular, görselleştirilmiş EV'nin bir ekzozom olduğunu ve küçük çaplı EV'lerin izolasyonunun başarılı olduğunu doğrular. Hat Histogram aracı ve X, Y, Z-plane View aracı kullanılarak ayrı ayrı izlenen diğer EV'lerde gerçekleştirilen boyut dağılımı analizi, fotoğraf çekme olaylarının çoğunun merkezin 100 nanometre yarıçapında gerçekleştiğini doğruladı.
Z ekseni boyunca hata artırıldı ve eksenel eksen boyunca EV'nin uzun bir son görüntüsü üretildi. Fotoğraf çekme olayları EV boyutuyla ilişkili değildi, bu da dSTORM tabanlı karakterizasyonun ekzozomlar gibi küçük EV'ler ve çapı 100 nanometreden küçük, zarflı virüsler için kullanılabileceğini gösterdi. dSTORM gerçekleştirirken, ilk lazer gücünü çok düşük ayarlamayı ve fotobleaching'i önlemek için görüntü alımı boyunca yavaşça yükseltmeyi hatırlamak önemlidir.
Gelişiminden bu yana, dSTORM araştırmacıların tipik ışık mikroskopisinin kırınım sınırı nedeniyle daha önce görselleştirilmesi imkansız olan hücre altı yapıların morfolojisini daha iyi anlamalarını sağladı.
