Bu yöntem, konak hücrelere bakteri yapışmasının hızlı ve yüksek verimli bir şekilde algılanmasını sağlar. Geleneksel kaplama yöntemleri ile karşılaştırıldığında, yapışık bakterilerin nicelleştirilmesi için gereken uygulamalı süreyi azaltır. Bu teknik otomatik, zaman kazandıran ve çok tekrarlanabilir.
Ayrıca, konak hücrelerin çoğuna da yaygın olarak uygulanır. Bu yöntem, çok basittir. İlk deneme için, enfeksiyonun çokluğu ve ayrıca konak bakteri ortak kuluçka süresi gibi koşullar optimize edilmelidir.
İlk önce bakteri kültürlerini üstel bir fazda oda sıcaklığında iki dakika boyunca 13.000 kez G'de santrifüjleme ile hasat edin. Hücre paletini bir mililitre PBS ile yıkadıktan sonra bakteri paletini bir mililitre PBS'de yeniden biriktirin. 600 nanometrede optik yoğunluğu ölçerek bakteriyel süspansiyon konsantrasyonlarını belirleyin.
Daha sonra, bakteri süspansiyonunu boyamak için, boyayı bir kat seyreltmek için bir mililitre bakteri süspansiyonuna 500 kat konsantre stok yeşili veya kırmızı boyama boyasının iki mikrolitresini ekleyin. Karanlıkta hafif dönüş ile hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya bırakın. 30 dakika sonra, lekeli bakterileri iki dakika boyunca 13.000 kez G'de santrifüjleyin ve peleti bir mililitre PBS'de yeniden diriltin.
Lekeli bakteri hücrelerini iki dakika boyunca 13.000 kez G'de santrifüjleme ile toplayın. Peletin bir mililitrelik taze F12 K ortamında yeniden kullanılabilir ve her kültürün optik yoğunluğunu 600 nanometre olarak ölçün. Daha sonra, enfeksiyonun çokluğuna ve konak hücre konsantrasyonuna bağlı olarak kültürleri istenen konsantrasyonlara seyreltin.
Bakteriyel Bağlılık Tahlilleri için, her kuyuya 100 mikrolitre sıcak PBS ekleyerek ve yavaşça yukarı ve aşağı pipet ekleyerek daha önce kültürlenmiş A549 hücre mono katmanlarını üç kez yıkayın. Ardından PBS'yi atın. Alternatif olarak, PBS ekledikten sonra 10 saniye bekleyin ve ardından vakum kullanarak PBS'yi çıkarın.
Bakteriyel ilişkinin kinetiğini belirlemek için, hücreleri farklı enfeksiyon çokluğuna sahip 100 mikrolitrelik bakteriyel süspansiyon konsantrasyonu ile kaplar. Bakterileri aşağı çevirin ve enfekte olmuş A549 hücrelerini 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksiti bir saat daha kuluçkaya yatırın. Mono katmanları gösterildiği gibi sıcak PBS ile beş kez yıkayarak ilişkisiz bakterileri temizleyin.
Daha sonra, buzdaki 96 kuyu plakasının tüm kuyularına% 4 formaldehitten oluşan 100 mikrolitre ekleyerek hücreleri sabitleyin. 15 dakika sonra, sabitleme çözeltisini çıkarmak için plakayı PBS ile üç kez yıkayın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca mililitre DAPI lekesi başına 50 nanogram ile çekirdekte leke.
Hücreleri PBS ile yıkadıktan sonra, kurumasını önlemek için enfekte olmuş A549 hücrelerini 100 mikrolitre PBS ile örtün ve ardından plakayı karanlıkta iki güne kadar dört santigrat derecede saklayın veya görüntüleme için devam edin. Veri bütünlüğünü korumak için, görüntüleri 20 kat büyütmede yakalamak için her kuyunun beş konumunu rastgele ve manuel olarak seçin. GFP kanalları altında bakterilerin floresan görüntülerini, DAPI altında A549 hücrelerini yakalayın ve kırmızı floresan boya ile lekelenen bakteriler için PE Si beş kanal kullanın.
Yumuşatma için yuvarlanan topun parametrelerini ayarlayın ve daha iyi çözünürlük elde etme hedefine göre görüntü dekonvolüyonunun nokta yayma işlevini otomatik olarak ölçün. Konak hücrelerin ve bakterilerin floresan yoğunluğunu ölçün. Konak hücrelerin ve bakterilerin en zayıf floresan yoğunluğunu hücre sayısı eşikleri olarak ayarlayın ve 15 mikrometre mesafedeki bir konak hücreye yakın olan tüm bakterileri yapışma bakterisi olarak sayın.
Hücreler tüm otomatik görüntülerden sayıldıktan sonra, konak hücre sayıları, hücre boyutları ve şekilleri, toplam bakteri sayısı ve bakteriyel yapışma belirlemek için en önemli gösterge olan konak hücre başına ortalama bakteri hesabı gibi kritik okumaları analiz edin. Bir saatlik ko inkübasyondan sonra, pseudomonas aeruginosa strain PAO1, A549 hücrelerine doza bağımlı bir şekilde yapıştı. Gram-pozitif bakteri listeria monocytogenes ve negatif kontrol basili subtilis olduğunda da benzer sonuçlar gözlenmiştir.
Konak yapışan P aeruginosa segmentasyonunun temsili bir görüntüsü, bu protokolü kullanarak bakteri hücrelerini sayma kolaylığını göstermektedir. Otomatik analizlerin sonuçları bakteriyel ve konak hücre sayılarını, konak hücre başına ortalama bakteri sayısını ve konak hücre sağlığının durumunu temsil eden konak hücre boyutlarını ve alanlarını, bakteriyel yapışma seviyesini ve bakteriyel sito toksisitesini içerir. A549 hücreleri dışında HUVEC'ler de bağlılık testi için test edildi.
Serratia rubidaea ve streptococcus agalactiae HUVEC'e bağlıydı, ancak A549 hücrelerine bağlı değildi ve bu yöntemi kullanarak birden fazla konağın konak bakteri etkileşimlerini incelemek için etkili bir şekilde tespit edildiğini ve uygunluğunu göstermektedir. Konak hücreler, kuyuların dibine istenmeyen bakteri yapışmasını en aza indirmek için yaklaşık% 90 ila% 100 birışıklığa ulaşmalıdır. Bu teknik, araştırmacıların yeni mekanizmaları, konak-haşere etkileşimlerini keşfetmelerini sağlayacaktır.
