Bu protokol, ex vivo ERG'de retina fonksiyonunu korumak için gereken koşulları, özellikle de ON-bipolar hücreler tarafından üretilen son derece hassas B dalgasını göstermektedir. Ex vivo ERG ile, farmakolojik ajanların kolayca tanıtılmasına izin verirken, yüksek sinyal-gürültü oranına sahip farklı retinal nöron tiplerinin işlevini ölçebiliriz. Bu yöntem özellikle farmakolojik ajanların retina fonksiyonu ve hastalığı üzerindeki etkinliğini ölçmek için uygundur.
Başlamak için, ex vivo ERG numune tutucuyu bir başlık aracılığıyla bir diferansiyel amplifikatöre bağlayarak çok elektrotlu bir dizi kurulumunu dönüştürün. Amplifikatör, çoklu elektrot dizi sisteminin arayüz kartının analog girişine takılmalıdır. ex vivo ERG'den giriş verilerini kaydetmek ve depolamak için çoklu elektrot dizisinin kayıt yazılımını kullanın.
Diferansiyel amplifikatörün kazancını 100'e ayarlayın ve sayısallaştırıcı özelliklerine bağlı olarak ek bir 10X voltaj amplifikasyonu ekleyin. Düşük geçiş filtresini 100 hertz olarak ayarlayın. Alternatif olarak, bir yama kelepçesi kurulumunu dönüştürmek için, ex vivo ERG numune tutucuyu bir far aracılığıyla yama kelepçesi amplifikatörünün baş kısmına bağlanması gereken bir diferansiyel amplifikatöre bağlayın.
ex vivo ERG'den giriş verilerini kaydetmek ve depolamak için yama kelepçe sistemi yazılımını ve sayısallaştırıcıyı kullanın. Parametreleri daha önce gösterildiği gibi ayarlayın. Uygun dalga boylarına sahip LED'leri mikroskopa bağlayın.
Işık uyaranlarını kontrol etmek için, bir sayısallaştırıcıdan analog çıkışlarla kontrol edilen bir LED sürücü kullanın. LED'leri, ışık uyaranlarının tetiklenmesini sağlayacak kayıt yazılımı ile kontrol edin. Ardından, LED'lerin ışık çıkışını bir fotodiyot kullanarak numune tutucudaki retina konumunda kalibre edin.
Gerekirse, ışık yolundaki ışık yoğunluğunu kısmak için nötr yoğunluk filtreleri takın. Elektrodu hazırlamak için, dişli bir yem konektörüne gümüş gümüş klorür pelet elektrodu yerleştirin. Yem konektörünün içini sıcak tutkalla doldurun ve dişli olmayan taraftan sıcak tutkalın içine iki milimetrelik bir soket takın.
EP-1 elektrodunun gümüş telini iki milimetrelik sokete lehimleyin. Bitmiş elektrotu diş üzerinde bir O-ring ile ex vivo ERG numune tutucunun elektrot portlarına vidalayın. İnsan donör gözleri de dahil olmak üzere büyük gözler için, kalan bağ dokusunun küresini temizleyin ve ön segmenti ve lensi çıkarın.
Limbustan yaklaşık üç milimetre kesim yapmak için bir neşter kullanın. Kavisli diseksiyon makasını kesiye yerleştirin ve gözün ön kısmını lensle çıkarmak için limbüs boyunca kesin. Üç ila altı milimetre tek kullanımlık biyopsi punch ile ex vivo elektroretinografi için retinal örnekler alın.
Dokuyu numune tutucuya monte etmek için, numune tutucunun alt yarısını büyük bir Petri kabına yerleştirin ve numune tutucunun kubbesi sadece suya batırılacak şekilde oksijenli Ames'medium ile doldurun. Retinanın kenarını ince forsepslerle dikkatlice kavrayın ve retinayı ex vivo numune tutucunun kubbesi, fotoreseptör tarafı yukarı bakacak şekilde aktarın. Retinanın yerinde kalmasına dikkat ederek numune tutucuyu Ames çözeltisinden kaldırın.
Gürültüyü, elektriksel çapraz konuşmayı ve sinyal şöntünü en aza indirmek için numune tutucunun plakasını tamamen kurulayın. Daha sonra numune tutucunun her iki yarısını dört vidayla birleştirin ve perfüzyon hattını bağlayın. Elektrodu numune tutucunun alt yarısında sürün ve anot kablosunu iç retinal tarafa ve katot kablosunu fotoreseptör tarafına bağlayın.
Işık tepkilerinin stabilize olmasına izin vermek için numune tutucuyu dakikada en az bir mililitre oksijenli Ames'medium ile 10 ila 20 dakika boyunca perfüze edin. Ex vivo ERG, fare retinasından fotoreseptör ve ON-bipolar hücre ışığı tepkilerinin kaydedilmesini sağladı. İnsan donör retinalarından fotoreseptör yanıtlarının kaydedilmesi, enükleasyonun beş saate kadar postmortem gecikmesi ve ON-bipolar hücre yanıtları için 20 dakikadan az gecikme ile mümkün olmuştur.
İdeal koşullar altında, her iki hücre tipindeki yanıt genlikleri ve kinetiği zamanla nispeten kararlıydı, ancak retinalar numune tutucuya monte edildikten 40 ila 45 dakika sonra yavaş bir düşüş gösterdi. Numune tutucudaki düşük sıcaklık, hem foto reseptörlerin hem de ON-bipolar hücrelerin kinetiğini büyük ölçüde yavaşlattı. Bununla birlikte, B dalgasının genliğini azalttı, ancak A dalgasının değil.
Tersine, perfüzyon hızını yavaşlatmak hem foto reseptörün hem de ON-bipolar hücre yanıtlarının genliklerini azalttı, ancak A veya B dalgasının örtük zamanını etkilemedi. Perfüzyonun 10 dakika boyunca kesilmesi ve ardından reperfüzyon, korunmuş fotoreseptör yanıtları ile ON-bipolar hücre fonksiyonunun tamamen kaybedilmesine neden oldu. Yeterli perfüzyon hızı ve fizyolojik sıcaklık, özellikle ex vivo ERG'deki ON-bipolar hücrelerden stabil yanıtlar elde etmek için kritik öneme sahiptir.
Bu protokol, insan makula ve periferisindeki fotoreseptör fonksiyonundaki farklılıkların derinlemesine araştırılmasına izin verir ve daha önce sadece insan olmayan primatlarda gerçekleştirilebilecek soruları yanıtlar.
