이 프로토콜은 생체 외 ERG, 특히 ON- 양극성 세포에 의해 생성 된 극도로 민감한 B 파에서 망막 기능을 유지하는 데 필요한 조건을 보여줍니다. ex vivo ERG를 사용하면 높은 신호 대 잡음비로 다양한 유형의 망막 뉴런의 기능을 측정할 수 있으며 약리학적 제제를 쉽게 도입할 수 있습니다. 이 방법은 특히 망막 기능 및 질환에 대한 약리학적 제제의 효능을 정량화하는 데 적합합니다.
시작하려면 헤드스테이지를 통해 ex vivo ERG 시편 홀더를 차동 증폭기에 연결하여 다중 전극 어레이 설정을 변환합니다. 증폭기는 다중 전극 어레이 시스템의 인터페이스 보드의 아날로그 입력에 연결해야 합니다. 다중 전극 어레이용 기록 소프트웨어를 사용하여 ex vivo ERG의 입력 데이터를 기록하고 저장합니다.
차동 증폭기의 게인을 100으로 설정하고 디지타이저 사양에 따라 10X 전압 증폭을 추가합니다. 저역 통과 필터를 100Hz로 설정합니다. 또는 패치 클램프 설정을 변환하려면 헤드스테이지를 통해 ex vivo ERG 시편 홀더를 패치 클램프 증폭기의 헤드스테이지에 연결해야 하는 차동 증폭기에 연결합니다.
패치 클램프 시스템 소프트웨어와 디지타이저를 사용하여 생체 외 ERG의 입력 데이터를 기록하고 저장합니다. 앞에서 설명한 대로 매개 변수를 설정합니다. 적절한 파장의 LED를 현미경에 연결합니다.
광 자극을 제어하려면 디지타이저의 아날로그 출력으로 제어되는 LED 드라이버를 사용하십시오. 빛 자극의 트리거링을 가능하게 하는 녹음 소프트웨어로 LED를 제어하십시오. 그런 다음 포토 다이오드를 사용하여 시편 홀더의 망막 위치에서 LED의 광 출력을 보정합니다.
필요한 경우 중성 밀도 필터를 삽입하여 광 경로의 광도를 어둡게 합니다. 전극을 준비하려면 염화은 펠릿 전극을 나사산 루어 커넥터에 삽입합니다. 루어 커넥터 내부를 뜨거운 접착제로 채우고 나사산이 없는 쪽에서 뜨거운 접착제에 2mm 소켓을 삽입합니다.
EP-1 전극의 은선을 2mm 소켓에 납땜합니다. 나사산에 O-링이 있는 완성된 전극을 생체 외 ERG 시편 홀더의 전극 포트에 나사로 고정합니다. 인간 기증자 눈을 포함한 큰 눈의 경우 나머지 결합 조직의 지구본을 청소하고 앞쪽 부분과 렌즈를 제거하십시오.
메스를 사용하여 윤부에서 약 3mm 정도 자릅니다. 구부러진 해부 가위를 절개 부위에 삽입하고 윤부를 따라 절단하여 렌즈로 눈의 앞쪽 부분을 제거합니다. 3-6mm 일회용 생검 펀치로 생체 외 전기 망막 조영술을 위한 망막 표본을 얻습니다.
표본 홀더에 조직을 장착하려면 표본 홀더의 아래쪽 절반을 큰 페트리 접시에 넣고 표본 홀더의 돔이 잠기도록 산소가 공급된 Ames'medium으로 채 웁니다. 미세한 집게로 망막의 가장자리를 조심스럽게 잡고 망막을 생체 외 시편 홀더의 돔으로 옮기고 광 수용체 쪽이 위를 향하게합니다. Ames의 용액에서 표본 홀더를 들어 올려 망막이 제자리에 유지되도록 주의하십시오.
소음, 전기 누화 및 신호 션트를 최소화하기 위해 시편 홀더의 플레이트를 완전히 건조시킵니다. 그런 다음 시편 홀더의 양쪽 절반을 4 개의 나사로 조립하고 관류 라인을 연결하십시오. 시편 홀더의 하반부에서 전극을 구동하고 양극 케이블을 내부 망막 쪽에 연결하고 음극 케이블을 광 수용체 측에 연결합니다.
시편 홀더에 분당 최소 1 밀리리터의 산소가 함유 된 Ames'medium을 10-20 분 동안 관류하여 빛 반응이 안정화되도록합니다. 생체 외 ERG는 마우스 망막에서 광수용체 및 ON-양극성 세포 광 반응을 기록할 수 있었습니다. 인간 공여자 망막으로부터의 광 수용체 반응의 기록은 핵 제거의 사후 최대 5 시간 지연 및 ON- 양극성 세포 반응의 경우 20 분 미만의 지연으로 가능했다.
이상적인 조건에서, 두 세포 유형 모두에서 반응 진폭 및 동역학은 시간이 지남에 따라 비교적 안정적이었으나, 망막이 표본 홀더에 장착된 후 40 내지 45분 후에 느린 감소를 보였다. 표본 홀더의 온도가 감소하면 광 수용체와 ON- 양극성 세포의 동역학이 크게 느려졌습니다. 그러나 B 파의 진폭은 감소했지만 A 파는 감소하지 않았습니다.
반대로, 관류 속도를 늦추면 광 수용체와 ON- 양극성 세포 반응의 진폭이 감소했지만 A 또는 B 파의 암시 적 시간에는 영향을 미치지 않았습니다. 10 분 동안 관류를 중단 한 후 재관류는 보존 된 광 수용체 반응으로 ON- 양극성 세포 기능의 완전한 손실을 초래했습니다. 충분한 관류 속도와 생리학적 온도는 특히 생체 외 ERG의 ON-양극성 세포로부터 안정적인 반응을 얻는 데 중요합니다.
이 프로토콜을 통해 인간 황반과 말초의 광 수용체 기능의 차이를 심층적으로 탐구 할 수 있으며, 이전에는 인간이 아닌 영장류에서만 수행 할 수 있었던 질문에 답할 수 있습니다.
