Transgenik farelerden genetiği değiştirilmiş hücrelerin kullanımında valf kireçlenmesine yol açan sinyal yolunu araştırmak için izole fare valf hücrelerinin kullanımı esastır. İki aşamalı sindirim hızlı ve verimli bir yöntemdir. Bu protokolün en zorlu kısmı, aort kapakçığının sekiz haftalık farelerden izole olmasıdır.
Aort kapakçığını daha iyi görselleştirmek için yaşlı fareler üzerinde pratik yapmak daha iyidir. Deneye başlamadan önce tüm cerrahi aletleri ve çalışma alanını %70 etanol ile temizleyip sterilize edin ve cerrahi aletleri 30 dakika boyunca otoklavlayın. İlk kurulum hazır olduğunda, etanol kullanarak sekiz haftalık ötenazili bir farenin göğsünü ve karın bölgesini temizlemekle başlayın.
Makas kullanarak, farenin karnını ve göğsünü açın, ardından küçük cerrahi makasla sol atriyum ve sol ventrikül arasında kesin. 10 mililitre soğuk PBS perfüzyon yaparak kalpten kan alın ve yükselen aortu üç milimetre tutarak kalbi kesin. Stereomikroskop altında, kalbi ventriküllerin ortasında yatay olarak keserek ve sol ventrikülü aorta doğru keserek aort kapağını parçalara ayırın, ardından aort kapağını dikkatlice parçalara ayırın.
Vanaları 35 milimetrelik küçük bir doku kültürü çanağını bir araya getir. İzole vanaları 75 mililitrelik hücre kültürü çanağını antibiyotiklerle desteklenmiş beş mililitre taze hazırlanmış 10 milimolar soğuk HEPES ile yıkayın ve beş mililitre kollajenaz tip birde 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca sürekli sallanarak kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, tüpü beş dakika boyunca, 150 kat G'de santrifüjleyin ve peletin iki mililitre 10 milimolar HEPES ile bir kez 30 saniye boyunca yüksek hızda girdapla yıkayın.
Sonuçta elde edilen süspansiyonu tüpten 35 milimetrelik bir kültür kabına toplayın ve doku parçalarını dikkatlice taze bir tüpe aktarmak için ince cımbız kullanın. Daha sonra peleti 35 dakika boyunca sürekli ajitasyon altında 37 santigrat derecede beş mililitre kollajenaz tip bir ile 15 mililitrelik bir tüpte kuluçkaya yatırın. Hücreleri, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 150 kez G'de bir mililitre pipet ve santrifüj ile yeniden direrek ayırın.
Ayrılmış peletin iki mililitrelik tam DMEM'de yeniden süngüle edilmesi ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 150 kez G'de santrifüjlenerek hücreleri iki kez temizleyin. Kaplama için, peletin bir mililitrelik tam orta dereceli olarak yeniden ıslatır ve minimum miktarda orta miktarda altı kuyu hücreli kültür çanağının bir kuyusuna ekleyin. Plakaları % 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede bozulmadan tutun.
Üç günlük kuluçkadan sonra, mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyerek doku kalıntılarına yakın büyümeyi onaylayın. 1.000 hücre görünür olduğunda, doku kalıntılarını otomatik kapatılmış cımbızla dikkatlice çıkarın ve ortamı değiştirin. %70 izdiah ettikten sonra hücreleri deneyin ve 75 mililitrelik doku kültürü çanağını aktarın.
Teste başlamadan önce, biyogüvenlik davlumbazını% 70 etanol ile temizleyin ve DMEM ortamını 37 santigrat dereceye ısıtın. Daha sonra, tohum 100,000 hücre başına altı kuyu plakasına tam DMEM ve kültür 37 santigrat derecede. 24 saat sonra, süpernatant ortamı kireçleme ortamıyla değiştirin ve hücreleri üçüncü gün ortamın yerini alarak 37 santigrat derecede yedi gün kuluçkaya yatırın.
Yedi gün sonra, Arsenazo III reaktifini kullanarak ve emiciyi 650 nanometrede kaydederek 96 kuyu plakasındaki kalsiyum konsantrasyonu ölçün. Temsili analizde, üç ila beş günlük kültürden sonra immünofluoresan lekeleme ile çeşitli kapak hücresi fenotipleri tespit edildi. Fare VIC'leri vimentin ve alfa SMA'sını ifade etti, valf hücrelerinin önemli belirteçleri.
Ek olarak, CD31 immünofluoresan boyama VIC kültüründeki endotel hücrelerinden bulaşma olmadığını doğruladı. Fosfat bakımından zengin kalsilme ortamı ile VIC'leri kültleme, hücrelerde bir kireçlenmeyi uyarır, kalsiyum düğümleri için kırmızı pozitif lekelenme ile daha da doğrulanmıştır. Protokol, farklı farelerden üç ila beş valflik bir havuza dayanmaktadır.
Bulguları doğrulamak için çöp eşi ve üç farklı biyolojik kopyanın kullanılması önemlidir. Fare valf hücrelerinin kullanımı, hücreleri transgenik farelerden izole ederek aort darlığı ile giden moleküler yolu anlamak için hayati öneme sahiptir. Bu protokol daha önce kireçlenmiş aort kapakçığının mineral gerilemesinde reseptöre giden yolun imasını araştırmak için kullanılmıştır.
