Bu protokolün benzersiz değeri, küçük laboratuvar alanlarında hazır ekipman kullanan iki personelin, 50 dönümlük bir operasyonel SIT programını desteklemek için yeterli steril mal sivrisinek üretebilmesidir. Bu tekniğin verimliliği ve düşük maliyeti, küçük sivrisinek kontrol bölgelerinin bile entegre vektör kontrol programlarını büyütmek için erişilebilir, zorlu hale getirir. Prosedürü gösteren, ben ve araştırma biriminden biyolojik bilim laboratuvarı teknisyenleri Barbara Bayer olacak.
Yetişkin Aedes aegypti'yi pupalardan korumak için, 0,84 x 0,84 milimetre delik boyutunda fiberglas örgü elemeli 60 x 60 x 60 santimetre katlanabilir alüminyum yetiştirme kafesleri ve her kafesin bir dikey duvarında bir erişim stoğu kılıfı hazırlayın. Her yetiştirme kafesinde Aedes aegypti pupa ile 1.900 mililitrelik bir plastik fincanı bire bir cinsiyet oranına yerleştirin ve manşonu kapalı tutun, bardakları yaklaşık dört gün boyunca 28 ila 30 santigrat derecede% 50'den fazla bağıl nemde% 50'den fazla bağıl nemde kafeslerde bırakın. Pupaları yetiştirme kafeslerine yerleştirdikten 24 saat sonra, her kafese bir sünger fitil ile% 10 sakkaroz çözeltisinden oluşan bir kap yerleştirin ve yetişkin sivrisineklere sırasıyla hidrasyon ve beslenme sağlamak için bir tel kancadan bala batırılmış 10 x 2 santimetrelik bir süngeri askıya alın.
Çoğu yetişkinin önümüzdeki üç ila dört hafta boyunca her iki ila üç günde bir ortaya çıkmasından 48 ila 72 saat sonra, bir kuzu derisi prezervatifini kafes başına 50 ila 100 mililitre defibrinlenmiş sığır kanı ile doldurun ve prezervatifleri sıcak su banyosunda yaklaşık 37 santigrat dereceye kadar ısıtın. Prezervatifleri havluyla dikkatlice okşadıktan sonra, kısmen kurutulmuş prezervatifleri 30 ila 60 dakika boyunca kafeslerin içindeki tek tek kağıt kaplı Petri kaplarına yerleştirin. Her kan beslemesinden 48 ila 72 saat sonra, 800 mililitre filtrelenmiş pupa suyu içeren ve bardağın iç çevresi boyunca hizalanmış 8 ila 10 x 30 santimetrelik bir tohum çimlenme kağıdı ile donatılmış 1.900 mililitrelik bir yumurtlama kabını her kafese yerleştirin.
Aedes aegypti larvalarını yumurtalardan korumak için, 5.000 ila 10.000 yumurta bulunan bir yumurtlama kağıdı kullanın ve yumurtlama çizgisine dik üç ila yedi santimetrelik bir bölüm kesin. Parçayı, yarısı musluk suyu ve bir tutam toz haline getirilmiş balık yemi gevreği ile doldurulmuş 460 mililitrelik yeni bir kaba yerleştirin. Tüm içeriği üç litre musluk suyu ve 50 mililitre kahverengi bulamaç içeren bir larva yetiştirme tavasına dökmeden önce kabı en az bir dakika boyunca kuvvetlice örtün ve çalkalayın.
Tavayı başlangıç tarihi, gerinim bilgileri ve besleme programı ile işaretleyin. Larva tavalarındaki larvaların yaklaşık eşik oranına ulaşıldıktan sonra, her bir tencerenin içeriğini 20 ila 40 elek büyüklüğünde bir elek boyunca dökün ve pupaları ve larvaları elek dışında üç litrelik dereceli bir plastik beherin içine yıkamak için bir şişe musluk suyu sıkın. Erkek pupaları larvalardan ve dişi pupalardan ayırmak için, her bir kabın içeriğini birden fazla 1.9 litrelik plastik kaplar arasında bölün ve bir pupa ayırıcının tabanındaki savağın altına sert sığ dört litrelik bir toplama kabı yerleştirin.
Musluk suyuyla yaklaşık dörtte üç dolu iki adet üç litrelik dereceli plastik kabı doldurun ve suyun separatörden sürekli akmasını sağlamak için üst ve alt düğmeleri ayarlarken suyu ayırıcının cam plakaları arasındaki boşluktan dökün. Duran su, plakaların tabanından yaklaşık 1,25 santimetre yükseklikte eşit bir şekilde toplandıktan sonra, ayırıcının alt düğmelerindeki başlangıç konumlarını bantla işaretleyin ve alt düğmeleri başlangıç konumlarından bir ila iki santimetre arasında saat yönünün tersine sürekli döndürürken pupa ve larva kaplarını ayırıcıya dökmeye başlayın. Larvaların çoğu veya tamamı savaklardan toplama kabına yıkandığında, su akışını duraklatın ve larvaların toplama kabını temizlemek için 30 numaralı elek kullanın.
Tüm larvalar çıkarıldığında, suyu dökün ve erkek pupaların toplama kabına yıkanmasına izin vermek için düğmeleri tekrar ayarlayın. Daha sonra erkek pupaları kaptan 20 numaralı bir elek içine dökün ve pupaları elek içinden ayrı bir 1.9 litrelik kaba yıkamak için bir litrelik sıkma şişesi musluk suyu kullanın. Tüm erkek pupalar toplandığında, suyu dökün ve dişi pupaların toplanmasına izin vermek için düğmeleri ayarlayın.
Dişi pupaları az önce gösterildiği gibi 1.9 litrelik yeni bir kaba aktarmak için 20 numaralı elek kullanmak. Sonra suyu dökün ve olgunlaşmamış sivrisineklerin tümü ayırıcıdan temizlenene kadar düğmeleri tekrar ayarlayın. Toplanan erkek pupaları bir elek ile süzün ve kakayı mümkün olduğunca az suyla bir litrelik dereceli bir beherde yıkayın.
Pupaları dikkatlice tek bir tabaka halinde nemli filtre kağıdı ile kaplı Petri kaplarına dökün. Çalışma sırasında pupa hareketini önlemek için taze üç mililitrelik mera pipeti kullanarak Petri kabının tabanından durgun suyu çıkarın. Petri tabaklarını ve istiflerini, ışınlama odasına sığacak şekilde etiketli 3,8 litrelik yeniden kapatılabilir bir torbanın içine kapatmadan önce paketleyin.
Yetişkin ışınlanmış erkek sivrisineklerin niceliklendirilmiş gruplarını işaretlemek için, yetiştirme kafesinden herhangi bir besin kaynağını çıkarın ve bir kafesi beş ila yedi dakika boyunca büyük bir karbondioksit odasına yerleştirin, duvarlara yapışan sivrisinekleri yerinden çıkarmak için kabın kenarlarını vurun. Maruz kalma süresinin sonunda, sivrisinekleri bir aspiratör şişesine aktarın ve sivrisinekleri beyaz kağıt kaplı bir çalışma yüzeyine sallamadan önce sivrisinekleri tekrar uyuşturun. Tüm erkekleri çalışma yüzeyinden yeni bir şişeye dikkatlice aspire edin ve tüm yetişkin erkekler tüm yetiştirme kafeslerinden toplanana kadar maruziyetleri ve toplamayı tekrarlayın.
Cinsiyet sıralama işlemi sırasında bir noktada, sadece 25 yetişkin erkek sivrisinek içeren bir şişe oluşturun. Tüm erkekler toplandığında, her bir sivrisinek aşağılığını bir terazide katranlı bir tartım teknesinde tartın ve tartılan sivrisinekleri hızlı bir şekilde 50 miligram bir işaretleme boyası içeren 240 mililitrelik bir karton kaba dökün. Tüm sivrisinekler hafifçe kaplanana kadar kabı saat yönünde ve saat yönünün tersine bir tam rotasyonla eğin ve döndürün ve sivrisinekleri yeni bir tartım teknesine dökün, ardından sivrisineklerin şarampole manşondan serbest bırakma kabına kanalize edilmesine izin vermek için tartım teknesini ikiye katlayın.
Serbest bırakma kabına yaklaşık iki gram erkek sivrisinek eklendiğinde, stockinette manşonu kapattı ve serbest bırakma kabının çerçevesindeki etiketleme bandını boya rengi, kap numarası ve sivrisineklerin toplam ağırlığı ile işaretleyin. Bu temsili erkek yetişkin Aedes aegypti sivrisinek yetiştirme, ışınlama ve pazarlama deneyinde, iki gram erkek yetişkin sivrisinek üç yetiştirme kafesinden ve sivrisinek başına ortalama ağırlığın hesaplanmasına izin vermek için iki kafesten 25 erkeklik iki şişe ile birlikte toplanabildi. Partilerin ikisinden toplam 25 dişi atıldı.
Larva yetiştirme haftası boyunca zamanında ve gözlemsel beslenme, ayrılma için iyi gelişmiş pupalar üretmek için kritik öneme sahiptir. Bu, erkekler ve dişiler arasında net bir ayrım yaparak, işaretleme adımlarında kadınların düşük oranda ortaya çıkmasına neden olur. Bunları operasyonel SIT programlarında kullanmanın yanı sıra, bu steril erkekler, yabani ışınlanmamış erkeklere kıyasla ışınlanmış çiftleşme rekabetini, hayatta kalmayı ve ışınlanmayı araştıran deneylerde de yaygın olarak kullanılabilir.
Tekniği dişi sivrisinekleri içerecek şekilde değiştirmek, ışınlanmış dişilerin kasıtsız salınımının doğurganlık ve vektör yeterliliği açısından etkisini araştırmamızı sağlar.
