Name: vector competence analyses on aedes aegypti mosquitoes using zika virus
Uploaded: 2020-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus at JoVE.com

Dünya Gelişmekte Olan Virüsler ve Arbovirüsler Referans Merkezi (WRCEVA) personelini kabul ediyoruz: Dr. Robert Tesh, Hilda Guzman, Dr. Kenneth Plante, Dr. Jessica Plante, Dionna Scharton ve Divya Mirchandani, bizim ve diğer grupların vektör yeterlilik deneyleri için kullanılan viral suşların birçoğunun küratörlüğünde ve sağlanmasında yorulmak bilmeyen çalışmalarından dolayı. Sunulan çalışma McLaughlin Burs Fonu (SRA) tarafından finanse edildi ve NIH AI120942 ve AI121452 hibeleri verdi.

Bu protokollerde gerçekleştirilen tüm işlemler, Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi ve Galveston Teksas Üniversitesi Tıp Şubesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokollere tam uyumlu olarak gerçekleştirildi.
1. Vero hücrelerinde ZIKV'nin amplify
<ol><li>Dulbecco'nun Eagle'ın minimum esansiyel ortamını (DMEM) %10 v/v ısı inaktive fetal sığır serumu (FBS) ve %1 (v/v) penisilin-streptomisin (100 U/mL ve 100 μg/mL) ile birlikte modifikasyonunda Vero hücrelerini (CCL-81 veya VeroE6) büyütün, sırasıyla) 150 cm 2 doku kültürü şişesinde %5 CO2 ila %80−90 arasında izdihat içeren nemlendirilmiş37 °C inkübatörde.</li>
	<li>Bir biyogüvenlik kabininde (BSC), ortamı çıkarın ve% 10 çamaşır suyuna veya çift kuaterner amonyumun(Malzeme Masası)çalışma seyreltilmesine atın. Monolayer'ı hücre başına 0,1−1 enfeksiyöz viral parçacığı hedefleyen 1 mL viral stokla hemen aşıleyin. Şişeyi hemen ajite edin, böylece inoculum monolayer ile bütünüyle temas eder.</li>
	<li>%2 v/v ısı inaktive FBS ve %1 (v/v) penisilin-streptomisin ile desteklenmiş DMEM kullanarak ortamı 5 mL hacme kadar yükseltin. Daha sonra şişeyi 60 dakika boyunca% 5 CO2 ile nemlendirilmiş 37 ° C inkübatöre hareket ettirin.</li>
	<li>Şişeyi inkübatörden çıkarın ve bir BSC'ye getirin. %2 v/v ısı inaktive FBS ve %1 (v/v) penisilin-streptomisin ile desteklenmiş DMEM kullanarak toplam 15 mL hacme ek ortam ekleyin. Şişeyi % 5 CO2ile nemlendirilmiş 37 °C inkübatöre taşıyın.</li>
	<li>Sitopatik etkilerin (CPE) kanıtı için faz kontrastı mikroskopisi altında şişeyi günlük olarak inceleyin. Hücrelerin sadece yaklaşık % 40−50'si monolayerde kaldığında viral hasada (adım 1.7) devam edin, genellikle kullanılan ZIKV suşuna bağlı olarak 3−5 gün postinfection.</li>
	<li>Süpernatantı aspire edin ve 50 mL konik şişeye yerleştirin. Hücresel kalıntıların üst kısmını santrifüjleme ile netleştirin (20 dakika boyunca 3.500 x g). NOT: Birden fazla şişe aynı şekilde enfekte olmuşsa, birden fazla şişeden gelen süpernatantlar 50 mL konik tüplerde birleştirilebilir.</li>
	<li>Peleti bozmamaya dikkat ederek, süpernatantı 50 mL konik tüpten yeni bir tüpe çıkarın. Süpernatantı ısı inaktive FBS ile %30 (v/v) son konsantrasyona tamamlar. Bu karışımı ayrı vidalı kapak tüplerine aliquotlayın ve kullanıma kadar -80 °C'de dondurun.</li>
</ol>2. Yapay kana susamlarının hazırlanması
<ol><li>Sivrisineklerin enfeksiyöz kan değerlerine maruz kalacakları gün, bir eklembacaklı muhafaza tesisinde, besleme ünitelerinin (MalzemeMasası ) sivrisinekler maruz kalmaya hazır hale geldiğinde öncedenısıtılacağışekilde güç kaynağını ( Malzeme Masası ) açın.</li>
	<li>Aşağıda açıklanan yöntemlerden birini kullanarak yapay kan metrinleri hazırlayın.<ol>
<li>Yöntem 1: Ticari olarak 1:1 v/v satın alınan taze hasat edilmiş (bir hafta içinde) sitratlanmış veya heparinize insan kanlarını viral stokla birleştirin (bölüm 1'de açıklandığı gibi hazırlanmıştır). NOT: Bu yöntem, kanda bulunan virüs/virüs ailesine karşı herhangi bir antikor bulunmamasına bağlı.</li>
		<li>Antikor yokluğu doğrulanamazsa veya kan kaynağının önceden flavivirüs maruziyeti olduğu biliniyorsa, eritrositleri yıkayın ve manuel olarak paketleyin.<ol>
<li>Bir BSC'de, 50 mL konik bir tüpe 30 mL tam insan kanı ekleyin ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile 50 mL'ye kadar üst üste yerleştirin.</li>
			<li>20 dakika boyunca 3.500 x g'da santrifüj.</li>
			<li>Süpernatantı, %10 çamaşır suyu içeren bir tepsi tavasına hafifçe dökerek veya eritrosit peletini atmamaya özenerek çift kuaterner amonyumun seyreltilmesiyle aspire edin.</li>
			<li>10 mL PBS ekleyin ve konik tüpün altına BSC'nin altına hafifçe dokunun, böylece eritrosit pelet yeniden inşa edilmiştir. PBS ile süspansiyonun hacmini 50 mL'ye kadar getirin. Nazik bir ters çevirme ile karıştırın.</li>
			<li>2.2.2.1−2.2.2.4 adımlarını toplam 4−6x tekrarlayın. Süpernatant'ın açık veya sadece hafif pembe olduğunu ve artık opak olmadığını onaylayın. Serolojik pipet kullanarak tüm süpernatant çıkarın. Eritrosit peletini 1−2 mL PBS'de yeniden dirildi.</li>
			<li>Kan mumunu birleştirin: 350 μL paketlenmiş eritrosit, %2 v/v ısı inaktive FBS ve %1 (v/v) penisilin-streptomisin ile desteklenmiş DMEM kullanılarak 100 μL%10 sakkaroz, 200 μL ısı inaktive FBS, 900 μM rekombinant ATP ve 2 mL uygun şekilde seyreltilmiş virüs stoğu.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enfekte olmayan bir farenin derisiyle standart bir 3 mL rezervuar ünitesini(Malzeme Masası)kapla (diğer seçenekler parafin filmi, kollajenli membranlar veya sosis muhafazası içerir).</li>
	<li>Kapalı rezervuarı beyaz kağıt havlulara yerleştirin. Rezervuara bir seferde 1 mL ~2 mL enfeksiyöz kan unu ekleyin. Besleyicinin altındaki havluyu sızıntı belirtisi olup olmadığını kontrol edin. Sızıntılar varsa, kan unu besleyicilerden kurtarın ve kapakları atın. Besleyicileri fişlerle kapatın. Sızıntı olmadığını bir kez daha onaylayın.</li>
</ol>3. Kan tahlili/plak testinin backtitration
<ol><li>Hazırlanan kan mumunun kalan hacmini kullanarak, %2 v/v ısı inaktive FBS ve %1 (v/v) penisilin-streptomisin ile desteklenmiş DMEM kullanarak 10x seri seyreltme serisi (yani seyreltilmiş 10x ila 1.000.000x arasında değişen 6 seyreltme) gerçekleştirin.</li>
	<li>24 veya 12 kuyu plakasının kuyularına seyreltmelerin Aliquot 100 μL'si en seyreltilmişten en konsantreye kadar.</li>
	<li>37 °C, %5 CO2 inkübatörde 1 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>1 saat kuluçka süresinin sonunda, plakaları BSC'ye geri getirin ve buna bağlı olarak 24 kuyu veya 12 kuyu plakasına 1 mL veya 2 mL metilselüloz kaplama ekleyin.</li>
	<li>Kaplamalı plakaları 37 °C, %5 CO2 inkübatöre geri yerleştirin ve 3−7 gün boyunca kuluçkaya yatır (virüs suşuna bağlı).</li>
	<li>Kuluçkadan sonra plakaları inkübatörden çıkarın ve BSC'ye getirin. Metilselüloz kaplamayı% 10 çamaşır suyu veya çift kuaterner amonyum dezenfektan içeren bir tepsi tavasına atın.</li>
	<li>Her kuyuyu PBS ile 2x yıkayın, yıkamayı% 10 çamaşır suyu veya çift kuaterner amonyum içeren bir tepsi tavasına atın.</li>
	<li>~1 mL metanol ekleyin:aseton (1:1 v:v) ve hücrelerin oda sıcaklığında (RT) BSC'de en az 30 dakika boyunca plakaya sabitlenebilmesine izin verin. Organik atıklar konusunda kurumsal politikaya göre metanol:aseton atın.</li>
	<li>Zikv'i aşağıda açıklanan iki yöntemden birini kullanarak görselleştirin.<ol>
<li>Metanol:asetonun çıkarılmasını takiben, 5 dakika boyunca kristal mor çözeltisi (%30 metanolde% 0.25 w / v) ile hemen leke. Musluk suyunda 2x durulayın ve kurumaya bırakın, ardından plakların veya monolayerin tahrip olduğuna dair kanıt için doğrudan gözle görselleştirin.</li>
		<li>Alternatif olarak, odak oluşturma tahlillerini gerçekleştirin.<ol>
<li>Organik fiksatif kalmayana kadar plakaların kurumasını bekleyin. NOT: Bu, BSC'nin dışında ~2−3 saat sürmelidir, ancak bir BSC veya kimyasal duman kaputunda hava kurutarak hızlandırılabilir.</li>
			<li>Her kuyuya 3x'i 15 dakika boyunca her biri bir yörünge plakası rocker'ında nonsterile PBS (Mg2+ ve Ca2+ free) ile yıkayın. PBS'yi çıkarın ve her kuyuya 1 mL engelleme çözeltisi (PBS + % 3 FBS) ekleyin ve RT'de 15 dakika boyunca kayan.</li>
			<li>Blokaj çözeltisinde 1:2.000 seyreltmede kuyu başına 100 μL α-ZIKV veya α-flavivirüs primer antikoru (örneğin, flavivirüs grubu hibridoma D1-4G2-4-15 [4G2]) ekleyin. RT'de en az 4 saat (tercihen gece boyunca, 18 saati geçmemek üzere) sallanarak kuluçkaya yatırın.</li>
			<li>Birincil antikoru çıkarın ve yörünge plakası rocker üzerinde PBS (Mg2+ ve Ca2+ serbest) ile her biri 15 dakika boyunca 3x yıkayın.</li>
			<li>Blokaj tamponunda 1:2.000 seyreltilmiş ikincil antikorun kuyusu başına 100 μL (keçi α fare HRP etiketli) ekleyin. RT'de 1 saat sallanarak kuluçkaya yaslanın.</li>
			<li>Yörüngesel plaka rocker üzerinde PBS (Mg2+ ve Ca2+ free) ile her biri 15 dakika boyunca 3x yıkayın.</li>
			<li>Kuyu başına Aliquot 100 μL substrat geliştirme reaktifi (Malzeme Tablosu). 15 dakika boyunca RT'de kaya plakaları.</li>
			<li>Substratı çıkararak ve plakaları musluk suyuyla 2 kat durulayarak odak/plakların gelişmesi üzerine reaksiyonu durdurun. Musluk suyunu dökün ve ölçülmeden önce plakaların havayla kurumasını bekleyin.</li>
			<li>Verilen örnekte bulunan FFU sayısını belirlemek için viral odakları sayın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Kan metrilerinin yönetimi
<ol><li>Eklozyondan 2−4 gün sonra Ae. aegypti sivrisineklerini kullanın. Dişi sivrisinekleri taranmış kapaklı 0,5 L karton kartonlar halinde sıralayın ve şekerden mahrum edin (genellikle bulaşıcı kan unu öncesinde 36−48 saat). Suya doymuş pamuk topları ile reklam libitum suyu sağlayın.</li>
	<li>Sivrisineklerin bulaşıcı kan emiciye maruz kalacağı sabah su doymuş pamuk toplarını çıkarın.</li>
	<li>Yapay kan metrinleri içeren rezervuarları, temiz bir plastik torpido gözü içindeki besleme ünitesi uçlarına takın.</li>
	<li>Torpido gözünde, rezervuara bağlı besleme ünitesinin altına 50−100 aç Ae. aegypti sivrisinek içeren, ekranlı kapaklı 0,5 L karton bir karton yerleştirin. NOT: Uygun şekilde aç sivrisinekler genellikle 20 dakika içinde beslenir. Besleme, daha yavaş popülasyonlarda örnek boyutunu artırmak için gerektiği gibi uzatılabilir, ancak bu 60 dakikadan fazla uzanmamalıdır, çünkü (ZIKV) viral titre besleyici içinde ~ 60 dakika sonra azalabilir.</li>
	<li>Besleme tamamlandıktan sonra, rezervuarı çıkarın ve taze yapılmış% 10 çamaşır suyuna daldının.</li>
	<li>Sivrisinekleri -20 °C'de 30 s veya buzdolabında 5 dakika kuluçka ile uyuşturmak.</li>
	<li>Torpido gözünde, sivrisinekleri buz üzerinde bir Petri kabına dökün. Engorged dişileri kategorize edilmemiş sivrisineklerden sayın ve sıralayın. Kategorize edilmemiş sivrisinekleri% 70 etanol ile dolu 50 mL tüp konik bir tüpe daldırarak atın. Sivrisinekler hala uyuşturulurken, onları 0.5 L karton kartona geri dökün ve ekran ve kapakla hızla örtün. Fazla ekran örgüsünü kartondan kesin ve ağı bantla sabitleyin.</li>
	<li>Her kartonun ekranına steril filtrelenmiş% 10 sulu sakkaroz ile doymuş bir pamuk topu ekleyin. Nemi korumak için tüm sivrisinek kartonlarını nemli bir süngerle büyük bir plastik ikincil kaba yerleştirin.</li>
	<li>Sivrisinek kartonları içeren ikincil kabı, %80 ± %10 bağıl nem ve 16:8 ışık:karanlık döngü ile 27 ± 1 °C sıcaklıkta (veya ilgi çekici bölgedeki koşulları simüle etmek için uygun olan) bir inkübatöre yerleştirin. Deneyler tamamlanana kadar sivrisinekleri% 10 sakkaroza ad libitum erişimi ile koruyun.</li>
</ol>5. Örnek alma ve işleme
<ol><li>Besleme sonrası belirtilen günlerde, bir torpido gözünde mekanik bir aspiratör kullanarak uygun kartonlardan önceden belirlenmiş sayıda sivrisinek aspire edin. Gerekli sayıda sivrisinek elde edildikten sonra toplama tüpünü pamuklu bir yuvarlakla kapla.</li>
	<li>Sivrisinekleri -20 °C'de 30 saniye veya 4 °C'de 5 dakika kuluçka ile uyuşturmak.</li>
	<li>Torpido gözünde, sivrisinekleri buz üzerinde bir Petri kabına dökün. İki çift toparlama kullanarak, her sivrisineğin altı bacağının altısını da çıkarın ve DMEM'den oluşan sterilize edilmiş paslanmaz çelik bilyalı rulman (7/32") ve 500 μL sivrisinek toplama ortamı (MCM) içeren prelabeled 2 mL yuvarlak alt mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin, %2 FBS, %1 penisilin-streptomisin ve 2,5 μg/mL amfoterisin.</li>
	<li>Sivrisinekleri dizginlemek için bir damla mineral yağın üzerine hafifçe yerleştirin, yağ ile sivrisinek başı ve hortumu arasında herhangi bir temasa izin vermemeye dikkat edin.</li>
	<li>Sivrisinek hortumunu 10 μL ısı inaktif FBS ile dolu 10 μL pipet ucuna yerleştirin. NOT: Alternatif olarak, pipet sakkaroz, kan veya mineral yağ ile doldurulabilir. Yağ, hafif mikroskopi ile tükürük kabarcıklarının doğrudan görselleştirilmesini sağlar.</li>
	<li>Sivrisinek 30 dakika tükürük izin verin. FBS + tükürük içeren mikropipette ucunu 100 μL MCM içeren bir mikrosantrifüj tüpüne çıkarın, ardından karkası sterilize edilmiş çelik bilyalı yatak ve 500 μL MCM içeren ayrı bir 2 mL yuvarlak alt mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Vücutlar, bacaklar ve tükürük için kullanılan tüplerin etiketli olduğundan emin olun, böylece üç numunenin de aynı sivrisinekten kaynaklandığı açıktır.</li>
	<li>Sivrisinekler tükürürken, kalan sivrisinekler üzerinde 5.3−5.5 adımlarını gerçekleştirin.</li>
	<li>Gövdeleri ve bacakları içeren tüpleri BSC içinde bulunan boncuk frezeleme dokusu homojenizasyon cihazına taşıyın. Viral parçacıkları süpernatanta serbest bırakmak için tüm vücut ve bacak örneklerini 5 dakika boyunca 26 Hz'de üçe katla. Hücresel kalıntıları peletmek için 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleme ile tüm örnekleri netleştirin. NOT: Bu noktada, numuneler -80 °C'de dondurulabilir veya hemen test edilebilir.</li>
</ol>6. ZIKV'nin enfeksiyöz test ile tespiti
<ol><li>Bir BSC'de, enfeksiyöz test başlangıcından önce 24 saat önce Vero hücreleri (kuyu başına10 5 hücre) ile 24 kuyu doku kültürü plakası hazırlayın. Her bir kuyuyu tek bir sivrisinek / örnek kimliği ile etiketleyin.</li>
	<li>Numuneler -80 °C'de dondurulduysa, çözülmesine izin verin.</li>
	<li>Numunelerle aşılamadan önce ortamı Vero hücre plakalarından birer birer çıkarın.</li>
	<li>Vücutlar veya bacaklar içeren örnekler için, her kuyuya dikkatlice 100 μL netleştirilmiş süpernatant aliquot, peletten sivrisinek hücresi kalıntılarını rahatsız etmemeye dikkat edin. NOT: Tükürük örnekleri, gerekirse daha sonraki titrasyon için numuneleri korumak için hücrelere aşılamadan önce MCM ile 1:1 (v/v) seyreltilebilir.</li>
	<li>Plakaları 37 °C, %5 CO2 inkübatöre alın ve 1 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Plakaları BSC'ye geri döndürün ve her kuyuya ~1 mL metilselüloz kaplama ekleyin. Kaplama plakalarını 37 °C, %5 CO2 inkübatöre geri yerleştirin ve 3−7 gün boyunca kuluçkaya yatırın (virüs/gerinime bağlı).</li>
	<li>3.6−3.9 adımlarında açıklandığı gibi sabitleme ve görselleştirme gerçekleştirin.</li>
	<li>Bir odak oluşturma testi ile puanlama ile ilgili olarak, hafif bir mikroskop altında muayene ile pozitif kuyuları ölçün. Bir kuyudaki hücrelerin intrasitoplazmik lekelemesinin tespiti virüsün varlığını gösterir. Örnekler yalnızca odak pozitif veya -negatif olarak puanlanır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Azar, S. R., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence:+What+Has+Zika+Virus+Taught+Us.">Vector Competence: What Has Zika Virus Taught Us.</a> Viruses. 11 (9), 867 (2019).</li><li>Souza-Neto, J. A., Powell, J. R., Bonizzoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+aegypti+vector+competence+studies:+A+review.">Aedes aegypti vector competence studies: A review.</a> Infection, Genetics and Evolution. 67, 191-209 (2019).</li><li>Smith, D. R., Adams, A. P., Kenney, J. L., Wang, E., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+in+the+Mosquito+Vector+Aedes+taeniorhynchus:+Infection+Initiated+by+a+Small+Number+of+Susceptible+Epithelial+Cells+and+a+Population+Bottleneck.">Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mosquito Vector Aedes taeniorhynchus: Infection Initiated by a Small Number of Susceptible Epithelial Cells and a Population Bottleneck.</a> Virology. 372 (1), 176-186 (2008).</li><li>Forrester, N. L., Coffey, L. L., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arboviral+bottlenecks+and+challenges+to+maintaining+diversity+and+fitness+during+mosquito+transmission.">Arboviral bottlenecks and challenges to maintaining diversity and fitness during mosquito transmission.</a> Viruses. 6 (10), 3991-4004 (2014).</li><li>Kramer, L. D., Ciota, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+vectorial+capacity+for+mosquito-borne+viruses.">Dissecting vectorial capacity for mosquito-borne viruses.</a> Current Opinion in Virology. 15, 112-118 (2015).</li><li>Kramer, L. D., Hardy, J. L., Presser, S. B., Houk, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissemination+Barriers+for+Western+Equine+Encephalomyelitis+Virus+in+Culex+tarsalis+infected+after+Ingestion+of+Low+Viral+Doses.">Dissemination Barriers for Western Equine Encephalomyelitis Virus in Culex tarsalis infected after Ingestion of Low Viral Doses.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 30 (1), 190-197 (1981).</li><li>Lounibos, L. P., Kramer, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasiveness+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+and+Vectorial+Capacity+for+Chikungunya+Virus.">Invasiveness of Aedes aegypti and Aedes albopictus and Vectorial Capacity for Chikungunya Virus.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214, 453-458 (2016).</li><li>Heitmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forced+Salivation+as+a+Method+to+Analyze+Vector+Competence+of+Mosquitoes.">Forced Salivation as a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57980 (2018).</li><li>Beerntsen, B. T., James, A. A., Christensen, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Mosquito+Vector+Competence.">Genetics of Mosquito Vector Competence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 115-137 (2000).</li><li>Guo, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culex+pipiens+quinquefasciatus:+a+potential+vector+to+transmit+Zika+virus.">Culex pipiens quinquefasciatus: a potential vector to transmit Zika virus.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 5 (9), 102 (2016).</li><li>Secundino, N. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+transmission+to+mouse+ear+by+mosquito+bite:+a+laboratory+model+that+replicates+the+natural+transmission+process.">Zika virus transmission to mouse ear by mosquito bite: a laboratory model that replicates the natural transmission process.</a> Parasites &amp; Vectors. 10 (1), 346 (2017).</li><li>Smith, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+Transmission+and+Effect+on+Pathogenesis.">Venezuelan Equine Encephalitis Virus Transmission and Effect on Pathogenesis.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (8), 1190-1196 (2006).</li><li>Lazear, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+of+Zika+Virus+Pathogenesis.">A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis.</a> Cell Host Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).</li><li>Morrison, T. E., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Zika+Virus+Infection,+Pathogenesis,+and+Immunity.">Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity.</a> Journal of Virology. 91 (8), 9-17 (2017).</li><li>Reynolds, E. S., Hart, C. E., Hermance, M. E., Brining, D. L., Thangamani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Overview+of+Animal+Models+for+Arthropod-Borne+Viruses.">An Overview of Animal Models for Arthropod-Borne Viruses.</a> Comparative Medicine. 67 (3), 232-241 (2017).</li><li>Rossi, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Novel+Murine+Model+to+Study+Zika+Virus.">Characterization of a Novel Murine Model to Study Zika Virus.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (6), 1362-1369 (2016).</li><li>Styer, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquitoes+inoculate+high+doses+of+West+Nile+virus+as+they+probe+and+feed+on+live+hosts.">Mosquitoes inoculate high doses of West Nile virus as they probe and feed on live hosts.</a> PLoS Pathogens. 3 (9), 1262-1270 (2007).</li><li>Azar, S. R., Diaz-Gonzalez, E. E., Danis-Lonzano, R., Fernandez-Salas, I., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+infected+Aedes+aegypti+collected+during+a+Zika+virus+outbreak+have+viral+titres+consistent+with+transmission.">Naturally infected Aedes aegypti collected during a Zika virus outbreak have viral titres consistent with transmission.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 8 (1), 242-244 (2019).</li><li>Dzul-Manzanilla, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+vertical+transmission+and+co-circulation+of+chikungunya+and+dengue+viruses+in+field+populations+of+Aedes+aegypti+(L.)+from+Guerrero,+Mexico.">Evidence of vertical transmission and co-circulation of chikungunya and dengue viruses in field populations of Aedes aegypti (L.) from Guerrero, Mexico.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 110 (2), 141-144 (2016).</li><li>Grard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+in+Gabon+(Central+Africa)+&#8211;+2007:+a+new+threat+from+Aedes+albopictus.">Zika virus in Gabon (Central Africa) &#8211; 2007: a new threat from Aedes albopictus.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681 (2014).</li><li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+epidemiology+reveals+multiple+introductions+of+Zika+virus+into+the+United+States.">Genomic epidemiology reveals multiple introductions of Zika virus into the United States.</a> Nature. 546 (7658), 401-405 (2017).</li><li>Guerbois, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreak+of+Zika+Virus+Infection,+Chiapas+State,+Mexico,+2015,+and+First+Confirmed+Transmission+by+Aedes+aegyti+Mosquitoes+in+the+America.">Outbreak of Zika Virus Infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and First Confirmed Transmission by Aedes aegyti Mosquitoes in the America.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).</li><li>Lundstrom, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sindbis+virus+polyarthritis+outbreak+signalled+by+virus+prevalence+in+the+mosquito+vectors.">Sindbis virus polyarthritis outbreak signalled by virus prevalence in the mosquito vectors.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (8), 0007702 (2019).</li><li>Miller, B. R., Monath, T. P., Tabachnik, W. J., Ezike, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemic+yellow+fever+caused+by+an+incompetent+mosquito+vector.">Epidemic yellow fever caused by an incompetent mosquito vector.</a> Tropical Medicine and Parasitology. 40 (4), 396-399 (1989).</li><li>Brown, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+Mosquito+Traps+in+Measuring+Species+Abundance+and+Composition.">Effectiveness of Mosquito Traps in Measuring Species Abundance and Composition.</a> Journal of Medical Entomology. 45 (3), 517-521 (2008).</li><li>Gorsich, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+assessment+of+adult+mosquito+trapping+methods+to+estimate+spatial+patterns+of+abundance+and+community+composition+in+southern+Africa.">A comparative assessment of adult mosquito trapping methods to estimate spatial patterns of abundance and community composition in southern Africa.</a> Parasites &amp; Vectors. 12 (1), 462 (2019).</li><li>Azar, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZIKV+Demonstrates+Minimal+Pathologic+Effects+and+Mosquito+Infectivity+in+Viremic+Cynomolgus+Macaques.">ZIKV Demonstrates Minimal Pathologic Effects and Mosquito Infectivity in Viremic Cynomolgus Macaques.</a> Viruses. 10 (11), 661 (2018).</li><li>Azar, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Vector+Competency+of+Aedes+albopictus+Populations+from+the+Americas+for+Zika+Virus.">Differential Vector Competency of Aedes albopictus Populations from the Americas for Zika Virus.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (2), 330-339 (2017).</li><li>Hanley, K. A., Azar, S. R., Campos, R. K., Vasilakis, N., Rossi, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Support+for+the+Transmission-Clearance+Trade-Off+Hypothesis+from+a+Study+of+Zika+Virus+Delivered+by+Mosquito+Bite+to+Mice.">Support for the Transmission-Clearance Trade-Off Hypothesis from a Study of Zika Virus Delivered by Mosquito Bite to Mice.</a> Viruses. 11 (11), 1072 (2019).</li><li>Hart, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Vector+Competency+of+Mosquitoes,+Gulf+Coast,+United+States.">Zika Virus Vector Competency of Mosquitoes, Gulf Coast, United States.</a> Emerging Infectious Diseases. 23 (3), 559-560 (2017).</li><li>Karna, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonized+Sabethes+cyaneus,+a+Sylvatic+New+World+Mosquito+Species,+Shows+a+Low+Vector+Competence+for+Zika+Virus+Relative+to+Aedes+aegypti.">Colonized Sabethes cyaneus, a Sylvatic New World Mosquito Species, Shows a Low Vector Competence for Zika Virus Relative to Aedes aegypti.</a> Viruses. 10 (8), 434 (2018).</li><li>Roundy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+Aedes+aegypti+Mosquito+Competence+for+Zika+Virus+Transmission.">Variation in Aedes aegypti Mosquito Competence for Zika Virus Transmission.</a> Emerging Infectious Diseases. 23 (4), 625-632 (2017).</li><li>Wilson, A. J., Harrup, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+relevance+in+insect-arbovirus+infection+studies.">Reproducibility and relevance in insect-arbovirus infection studies.</a> Current Opinion in Insect Science. 28, 105-112 (2018).</li><li>Hagan, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dehydration+prompts+increased+activity+and+blood+feeding+by+mosquitoes.">Dehydration prompts increased activity and blood feeding by mosquitoes.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6804 (2018).</li><li>Guo, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Feeding+Patterns+of+Mosquitoes+in+a+Rural+Malaria-Endemic+Region+in+Hainan+Island,+China.">Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).</li><li>Kuno, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+history+of+laboratory+breeding+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+focusing+on+the+origins+and+use+of+selected+strains.">Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains.</a> Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).</li><li>Mayilsamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+Long+Viability+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+Eggs+Stored+Under+Normal+Room+Condition.">Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition.</a> Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).</li><li>Althouse, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+for+Zika+Virus+to+Establish+a+Sylvatic+Transmission+Cycle+in+the+Americas.">Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055 (2016).</li><li>Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fever+from+the+forest:+prospects+for+the+continued+emergence+of+sylvatic+dengue+virus+and+its+impact+on+public+health.">Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).</li><li>Vasilakis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+ancestral+sylvatic+dengue-2+viruses+to+re-emerge.">Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge.</a> Virology. 358 (2), 402-412 (2007).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada açıklanan yöntemler vektör yetkinlik analizleri yapmak için genelleştirilmiş bir iş akışı sağlar. Genel bir çerçeve olarak, bu metodolojilerin çoğu literatür boyunca korunmaktadır. Ancak, değişiklikler için önemli bir alan vardır (Azar ve Weaver1'deincelenmiştir). Virüs (örneğin, viral soy, meydan okuma virüsünün depolanması, viral geçiş geçmişi), entomoloji (örneğin, sivrisinek popülasyonlarının laboratuvar kolonizasyonu, doğuştan gelen bağışıklık, sivrisinek mikrobiyomu / virom) ve deneysel değişkenler (örneğin, kan eti bileşimi, sıralı kan besleme ve kuluçka sıcaklığı) vektör yeterliliğini etkilediği bilinmektedir. Yetkinlik çalışmalarında metodolojik değişkenlik, ZIKV salgını bağlamında sorunlu olduğunu kanıtlamıştır, çünkü resmi meta-analizlerin 1,33.'nünönüne geçmiştir.
Bu genel metodolojide, sivrisineklerin uygun açlığın ve kan unu makyajının önemi abartılamaz. Dehidrasyonun, sivrisineklerin kan besleme davranışını laboratuvar paradigmalarında yönlendirdiği bilinmektedir34Bulaşıcı bir kan unu sunmadan önce şeker ve su açlığı değerinin altını çizer. Kan kütlüye maruz kalmadan önce 36-48 saat şeker ve 2-4 saat su yoksunluğu Ae. aegyptitarafından iyi tolere edilirken, bu sivrisineklerin laboratuvar koşullarında çalışmasının oldukça kolay olduğunu belirtmek gerekir2. Bu tür agresif açlık rejimleri, diğer sivrisinek türleri tarafından neredeyse iyi tolere edilmeyebilir ve bir dereceye kadar şirket içi optimizasyon gerektirebilir. Aynı şekilde kan ımsası içeriği de konak tercihi ile bilgilendirilmiş olabilir. Örneğin, Ae. aegypti gibi antropofilik sivrisinekler için kan kütlüğü hazırlamak için insan kanı kullanmak tamamen uygundur, ancak Culex quinquefasciatus gibi ornitofilik türler için yapılan insan kana suları daha az etkili olabilir35. Ek olarak, kan teresi montajı ile ilgili olarak, eritrositlerin hemolizini en aza indirmek için nispeten taze kan ürünlerinin kullanılması şiddetle tavsiye edilir.
Vektör yeterliliği değerlendirmesinin bir bütün olarak en büyük sınırlamalarından biri ve burada açıklanan prosedürler, bu çalışmaların büyük ölçüde laboratuvar koşullarında sürdürülebilen sivrisinekleri kullanan virüsleri araştırmakla sınırlı olmasıdır. Ae. aegypti, klinik öneme sahip çok sayıda patojen için son derece alakalı bir vektör olsa da, laboratuvar kolonilerinde1 , 31,36,37' de arkalanması ve bakımı en kolay sivrisineklerden biridir. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, Ae. aegypti popülasyonlarının yeterliliği genellikle yaygın vektör sivrisinekleri arasında en iyi karakterizedir2. Vektör yeterliliği genellikle sadece daha çekişli kentsel sivrisinekler bağlamında yürütüldüğünden, bu özellikle hem enzootik hem de kentsel iletim döngüleri38,39,40'ı koruyan arbovirüsler bağlamında sorunludur.

Vektör yeterliliği, sivrisinek, kene veya flebotomin kum sineği gibi belirli bir eklembacaklının tür, popülasyon ve hatta bir birey düzeyinde, eklembacaklıda çoğaltma veya geliştirme ile biyolojik olarak bir ajan edinme ve iletme yeteneği olarak tanımlanır1,2. Sivrisinekler ve eklembacaklı kaynaklı virüsler (yani arbovirüsler) ile ilgili olarak, ajan dişi bir sivrisinek tarafından viremik bir konakçıdan imbibed edilir. Yutulduktan sonra, virüs küçük bir midgut epitel hücre popülasyonu3, sindirim enzimleri tarafından proteolitik bozulma, mikrobiyotanın varlığı (midgut enfeksiyon bariyeri veya MIB) ve salgılanan peritrofik matris gibi çeşitli fizyolojik engellerin üstesinden gelmelidir. Midgut epitelinin enfeksiyonu, virüsün replikasyonu ve midgut'tan sivrisineklerin açık dolaşım sistemine veya midgut kaçış bariyerinin (MEB) üstesinden gelen yaygın bir enfeksiyonun başlangıcını temsil eden hemolimf'e nihai kaçış ile takip edilmelidir. Bu noktada virüs ikincil dokuların (örneğin, sinirler, kaslar ve yağ organları) enfeksiyonlarını oluşturabilir ve çoğalmaya devam edebilir, ancak bu tür ikincil replikasyon, virüsün tükürük bezlerinin acınar hücrelerini enfekte etmesi için kesinlikle gerekli olmayabilir (tükürük bezi enfeksiyon bariyerinin üstesinden gelmek). Tükürük bezi acinar hücrelerinden apikal boşluklarına dökülür ve daha sonra tükürük kanalına hareket etmek, virüsün ısırma sırasında sonraki konaklara aşısını sağlar ve iletim döngüsünü 1 ,2,4,5,6,7tamamlar.
Bir sivrisinek vektörü içinde bu iyi karakterize edilmiş ve genel olarak korunmuş yayılma mekanizması göz önüne alındığında, protokollerdeki farklılıklar mevcut olmasına rağmen, laboratuvar vektör yetkinlik değerlendirmeleri genellikle metodolojik olarak benzerdir1,2. Genellikle, oral virüse maruz kaldıktan sonra, sivrisinekler, midgut, bacaklar, yumurtalıklar veya tükürük bezleri gibi bireysel dokuların viral enfeksiyon, yaygın enfeksiyon, yaygın enfeksiyon / potansiyel transovariyal bulaşma ve yaygın enfeksiyon / potansiyel bulaşma yeterliliği için sırasıyla8olarak test edilebilmesi için parçalara ayrılırken. Bununla birlikte, tükürük bezlerinde sadece bir virüsün varlığı, bazı vektör / virüs kombinasyonlarında tükürük bezi kaçış / çıkış bariyerinin (SGEB) kanıtı göz önünealındığında,bulaşma kabiliyetinin kesin kanıtı değildir1,2,4 ,5,7,9. Bulaşma yetkinliğini kanıtlamak için standart yöntem, hassas bir hayvana sivrisinek iletimi olmaya devam etmektedir10,11,12. Bununla birlikte, birçok arbovirüs için bunun immün sistemi baskılanmış murine modellerinin kullanılmasını gerektirdiği göz önüne alındığında13,14,15,16, bu yöntem genellikle maliyet-yasaklayıcıdır. Yaygın olarak kullanılan bir alternatif, sırasıyla viral genomun veya enfeksiyöz parçacıkların varlığını göstermek için ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) veya bulaşıcı bir test ile analiz edilebilen sivrisinek tükürüğünün toplanmasıdır. Bu tür in vitro tükürük toplama yöntemlerinin12'yi abartabileceğini veya in vivo besleme sırasında biriken virüs miktarını17'yi hafife alabileceğini belirtmek gerekir, bu da bu verilerin dikkatli bir şekilde yorumlanması gerektiğini gösterir. Bununla birlikte, in vitro yöntemi tükürükteki sadece virüs varlığı açısından analiz edildiğinde, bulaşma potansiyelini gösteren oldukça değerlidir.
Arboviral hastalık salgınlarında sivrisinek vektörlerinin rolünü belirlemek için iki ana yaklaşım vardır. İlk yöntem, sivrisineklerin aktif bulaşma 18 , 19 , 20 ,21,22,23,24bağlamında toplandığı saha gözetimini içerir. Bununla birlikte, enfeksiyon oranlarının tipik olarak oldukça düşük olduğu göz önüne alındığında (örneğin, Amerika Birleşik Devletleri'nde aktif Zika virüsü (ZIKV) dolaşımı alanlarında sivrisineklerin tahmini%0.061enfeksiyon oranı 21 ), potansiyel vektör türlerinin suçlanması, metodoloji25,26 ve rastgele şans (örneğin, enfekte olmayan 1.600 kişiden bir enfekte bireyi örneklemek) tarafından ağır bir şekilde önyargılı olabilir21 . Bunu dikkate alarak, belirli bir çalışma, bulaşmada yer alan sivrisinekleri doğru bir şekilde örneklemek için hem ham sayılarda hem de tür çeşitliliğinde yeterli sivrisinek elde etmeyebilir. Buna karşılık, vektör yeterlilik analizleri laboratuvar ortamında gerçekleştirilen ve oral doz gibi parametrelerin sıkı bir şekilde kontroline olanak sağlar. Sivrisinek enfeksiyonunun gerçek karmaşıklığını ve bulaşma yeteneğini bir alan ortamında tam olarak temsil edemese de, bu laboratuvar değerlendirmeleri arboviroloji alanında güçlü araçlar olmaya devam etmektedir.
Çeşitli sivrisinek türlerinde, popülasyonlarında ve yöntemlerinde ZIKV ile yapılan çeşitli vektör yetkinlik analizlerine dayanarak27,28,29,30,31,32, ve vektör yeterlilik değerlendirmelerinin yakın tarihli bir incelemesi1, burada tipik bir vektör yeterlilik iş akışı ile ilişkili protokollerin birkaçını açıklıyoruz. Bu deneylerde, Amerika'dan üç Ae. aegypti popülasyonu (Salvador şehri, Brezilya; Dominik Cumhuriyeti; ve aşağı Rio Grande Vadisi, TX, ABD) yapay kan lekeleri yoluyla 4, 5 veya 6 kütük 10 odak oluşturan ünitelerde (FFU)/mL dozlarında tek bir ZIKV (Mex1-7, GenBank Katılım: KX247632.1) türüne maruz kaldı. Daha sonra, diseksiyon ve hücre kültürüne dayalı bulaşıcı bir tahlil yoluyla çeşitli dış inkübasyon zamanlarından (2, 4, 7, 10 ve 14 gün) sonra enfeksiyon, yaygın enfeksiyon ve bulaşma yeterliliği kanıtları için analiz edildiler. Mevcut iş akışı/protokoller ZIKV için optimize edilmiş olsa da, birçok öğe eklembacaklı muhafaza ve biyogüvenlik düzeyleri 2 ve 3'teki (ACL/BSL2 veya ACL/BSL3) diğer sivrisinek kaynaklı arbovirüslere doğrudan çevrilebilir.

<table><tbody><tr><td>3mL Standard Reservoir</td><td>R37P30</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>7/32&quot; Stainless Steel 440 Grade C Balls</td><td>4RJH9</td><td>Grainger</td><td>Grinding Media</td></tr><tr><td>Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case</td><td>A16-P4</td><td>FisherScientific</td><td>Fixative</td></tr><tr><td>Adenosine 5&#039;-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture</td><td>A6419-1G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15</td><td>MAB10216</td><td>MilliporeSigma</td><td>Primary Antibody for focus forming assay</td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle</td><td>5450-0011</td><td>KPL/Seracare</td><td>Secondary Antibody for focus forming assay</td></tr><tr><td>Bleach</td><td>NC0427256</td><td>FisherScientific</td><td>Decontamination</td></tr><tr><td>Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50</td><td>10-126-34</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture consumable</td></tr><tr><td>Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning</td><td>07-200-740</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture consumable</td></tr><tr><td>Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning</td><td>07-200-91</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture consumable</td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>C0775-100G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Stain</td></tr><tr><td>Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case</td><td>05-402-7</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes</td><td>14-959-70C</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes</td><td>14-959-49A</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case</td><td>13-675-20</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case</td><td>13-675-15B</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case</td><td>13-675-30</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case</td><td>13-675-22</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td><td>08-772B</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL</td><td>S11150</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides</td><td>12-550-A3</td><td>FisherScientific</td><td>Immobilization of Mosquitos</td></tr><tr><td>FU1 Feeder</td><td>FU1-0</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment; feeding units</td></tr><tr><td>Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles</td><td>140-040-182</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250&amp;mu;g/mL, 50mL/Bottle</td><td>15-290-026</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case</td><td>15-140-163</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles</td><td>25-200-114</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles</td><td>11-965-118</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit</td><td>7203706</td><td>Lampire</td><td>Bloodmeal preparation</td></tr><tr><td>InsectaVac Aspirator</td><td>2809B</td><td>Bioquip</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case</td><td>A412-4</td><td>FisherScientific</td><td>Fixative</td></tr><tr><td>Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 &amp;deg;C), 250g/Bottle</td><td>M0512-250G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Micro-chem Plus Disinfectant Detergent</td><td>C849T34</td><td>Thomas Scientific</td><td>Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium</td></tr><tr><td>Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology</td><td>M5904-5X5ML</td><td>MilliporeSigma</td><td>Immobilization of Mosquitos</td></tr><tr><td>O-rings</td><td>OR37-25</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>Plastic Plugs</td><td>PP5-250</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>PS6 Power Unit (110-120V)</td><td>PS6120</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment; power source</td></tr><tr><td>Rubis Forceps, Offset blades, superfine points</td><td>4525</td><td>Bioquip</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case</td><td>50-809-242</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Sucrose, BioUltra, for molecular biology</td><td>84097-250G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000&amp;mu;L Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case</td><td>21-402-487</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200&amp;mu;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td><td>21-402-486</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20&amp;mu;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td><td>21-402-484</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10&amp;mu;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td><td>21-402-482</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>85300</td><td>QIAGEN</td><td>Homogenization</td></tr><tr><td>TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL</td><td>5510-0030</td><td>Seracare</td><td>Developing solution for focus forming assay</td></tr><tr><td>Vero</td><td>CCL-81</td><td>American Type Culture Collection</td><td>Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay</td></tr><tr><td>Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6]</td><td>CRL-1586</td><td>American Type Culture Collection</td><td>Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay</td></tr></tbody></table>

vector competence analyses on aedes aegypti mosquitoes using zika virus

Sunulan prosedürler, söz konusu sivrisinek popülasyonunda enfeksiyon oranını, yayılan enfeksiyonu ve virüsün potansiyel bulaşma oranını belirlemek için laboratuvar koşullarında Aedes aegypti sivrisineklerini Zika virüsü ile enfekte etmek için genelleştirilmiş bir metodolojiyi açıklamamaktadır. Bu prosedürler, küresel olarak vektör yeterliliği değerlendirmelerinde çeşitli değişikliklerle yaygın olarak kullanılmaktadır. Belirli bir sivrisinin (türler, popülasyon, birey) belirli bir ajanın iletiminde oynayabileceği potansiyel rolü belirlemede önemlidirler.

Amerika'dan Ae. aegypti'nin üç nüfusu (Salvador, Brezilya; Dominik Cumhuriyeti; ve Rio Grande Vadisi, TX, ABD), yıkanmış bir insan eritrosit bazlı yapay kana sunakta sunulan bir dizi kan memesi (4, 5 ve 6 kütük 10 FFU/mL) üzerinde Amerika'dan (ZIKV Mex1-7, Chiapas State, Mexico, 2015) zikv salgınına maruz kaldı. 2, 4, 7, 10 ve 14 postenfection günlerinde, sivrisineklerin alt kümeleri enfeksiyon, yayılma ve potansiyel bulaşma oranlarını belirlemek için işlendi.
ZIKV Mex 1−7'nin 4 kütüğü10 FFU/mL kan memelisinde, Salvador, Brezilya'dan Ae. aegypti, 4 ve 14 günlük dış inkübasyondan sonra sırasıyla% 12.5 ve% 11.1 oranında enfekte oldu, test edilen bacaklarda yayılan enfeksiyon belirtisi yok ve tükürükte virüs tespit edildi (Şekil 1a). Titerin 5 kütüğeyükseltilmesi 10 FFU/mL, 4, 10 ve 14 postinfection günlerinde sırasıyla %22,2, %33,3 ve %22,2 oranlarıyla enfektivitede marjinal bir artışa neden oldu. 4 kütük10 FFU/mL'ye maruz kalan kohortta gözlemlenenlere benzer şekilde, herhangi bir zaman noktasında yaygın enfeksiyon veya bulaşma yeterliliği gözlenmedi(Şekil 1b). En yüksek incelenmiş titrede (6 log10 FFU/mL) 2 günlük inkübasyondan sonra enfeksiyon tespit edilmedi, ancak diğer tüm zaman noktalarında enfeksiyonlar gözlendi ve 10 günlük dışsal inkübasyon ile% 88.9'da zirve yaptı. 10 ve 14 günlük postenfeksiyonda (sırasıyla%22,2 ve %66,7) incelenen sivrisineklerin bacaklarında ZIKV tespit edildi, bu da ZIKV'nin hemokole yayıldığını gösterir, ancak bu zaman noktalarında tükürükte bulaşıcı ZIKV gözlenmiştir (Şekil 1c).
Dominik Cumhuriyeti'nden Ae. aegypti popülasyonu ZIKV enfeksiyonuna en duyarlı olduğunu kanıtladı ve test edilen tüm kan memesi titrelerine maruz kaldıktan sonra bulaşmaya yetkindi. Test edilen üç dozda da tüm zaman noktalarında bir miktar enfeksiyon gözlendi ve en düşük oran 4 log10 FFU/mL'de (%25) 2 gün postinfection gözlendi (Şekil 1d). 5 kütüp10 ve 6 kütüp10 FFU/ mL'lik kan tırtılları ile enfeksiyon oranları% 100'e ulaştı, 6 kütüğe maruz kalan sivrisinek popülasyonunda 4 gün postenfeksiyon kadar erken %100 enfeksiyon gözlendi 10 FFU / mL ZIKV (Şekil 1e,f). Her üç dozu da besleyen sivrisinekler, 7 gün sonra yayılma gösterdi, %44,4 (4 log10 FFU/mL, 14 gün postinfection), %88,9 (5 log10 FFU/mL, 1 ve 14 gün postinfection) ve %100 (6 log10 FFU/mL, 10 gün postinfection) ile zirve yaptı. İletim yeterliliği her üç dozdan sonra gözlendi (sırasıyla 4, 5 ve 6 günlük 10 FFU/mL'de%11.1, % 22.2 ve% 22.2), ancak sadece 14 günlük dışsal inkübasyon süresini (EIP) takip etti (Şekil 1d−f).
Rio Grande Vadisi, TX'ten Ae. aegypti popülasyonu, ZIKV enfeksiyonuna nispeten refrakter olduğunu kanıtladı. 4 kütük10 FFU / mL kan memesi titrelerine maruz kalan sivrisinekler, 4 gün sonra enfekte oldu ve enfeksiyon oranları% 22.2 ile% 44.4 arasında. Bu maruziyet koşullarında, yaygın enfeksiyonlar 14 gün postinfeksiyonda% 11,1 oranında gözlenmiş ve bulaşma yeterliliği gözlenmedi(Şekil 1g). Kan memesi titresinde on kat artış, 4 gün sonra (%33,3 ve %44,4) başlayan enfeksiyonlarla büyük ölçüde benzer bir sonuç üretirken, 14 günlük dışsal inkübasyondan sonra% 22,2 oranında yayılan enfeksiyonlar bulundu (Şekil 1h). Son olarak, 6 kütüğe maruz kalan kohortta10 FFU/mL kan unu, enfeksiyon 2 günlük postinfeksiyon zaman noktasından (%22.2) başlayarak gözlendi ve 4, 10 ve 14 günlük postinfeksiyonda (%66.7) zirvelere ulaştı. Bu durumdaki yaygın enfeksiyonlar 7 gün postinfeksiyonda (%11.1) gözlenmeye başladı ve 14 gün sonra %44.4 ile zirve yaptı. Sadece tek bir sivrisineğin (%11.1) 10 gün postinfection'da bulaşabildiği gözlendi (Şekil 1i).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61112/61112fig01.jpg"> Şekil 1: ZIKV Mex 1−7 için çeşitli Ae. aegypti popülasyonlarının temsili vektör yetkinlik verileri. (a−c) Salvador, Brezilya'dan Ae. aegypti'nin vektör yeterliliği (F2). (d−f) Dominik Cumhuriyeti'nden (F6) Ae. aegypti'nin vektör yeterliliği. (g−i) Rio Grande Vadisi, TX 'den (F4) Ae. aegypti'nin vektör yeterliliği. (a,d,g) Ae. aegypti ZIKV Mex1-7'nin 4 kütüğü 10 FFU/mL'ye maruz kaldı. (b,e,h) Ae. aegypti ZIKV Mex1-7'nin 5 kütüğü 10 FFU/mL'ye maruz kaldı. (c,f,i) Ae. aegypti ZIKV Mex1-7'nin 6 kütüğü 10 FFU/mL'ye maruz kaldı. Her zaman noktasında (2, 4, 7, 10 ve 14 gün sonra) bir sivrisinek alt kümesi toplandı ve örneklendi. Enfeksiyon, yayılma ve bulaşma oranları, o zaman noktasında test edilen sivrisinek sayısı üzerinden pozitif karkas/bacak/tükürük örneği sayısı olarak sunulmaktadır. Mavi ile temsil edilen enfeksiyon, yeşil ile temsil edilen yaygın enfeksiyonlar ve kırmızı ile temsil edilen bulaşma oranı. Bu şekildeki veriler Roundy ve Azar ve ark.32'den değiştirilmiştir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61112/61112fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus at JoVE.com

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Sunulan protokol, Aedes aegypti sivrisinek popülasyonlarının Zika gibi belirli bir virüs için vektör yeterliliğini bir muhafaza ortamında belirleyebilir.

Zika Virüsü Kullanan Aedes aegypti Sivrisineklerinde Vektör Yetkinlik Analizleri

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

vector-competence-analyses-on-aedes-aegypti-mosquitoes-using-zika

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

2.9K Görüntüleme.  University of Texas Medical Branch. Sunulan protokol, Aedes aegypti sivrisinek popülasyonlarının Zika gibi belirli bir virüs için vektör yeterliliğini bir muhafaza ortamında belirleyebilir.

Video: Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

Culex quinquefasciatus'ta Verimli Bölgeye Özgü Mutagenezi için Embriyo Mikroenjeksiyon Teknikleri

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Genetik

Genome Editing in the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti using CRISPR-Cas9

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering field and opened the doors for precise genome editing in multiple species, including non-model organisms. In the mosquito Aedes aegypti, loss-of-function mutations and DNA insertions have been accomplished with this technology. Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology, focusing on both the generation of gene knockout and knockin lines. In this protocol, quartz needles are filled with a mixture of guide RNA, recombinant Cas9, and a plasmid containing a DNA cassette encoding a gene for a fluorescent marker, if gene knockin is desired. Embryos at the preblastoderm stage are lined up onto a strip of double-sided sticky tape placed onto a coverslip, which is subsequently mounted onto a glass slide. With the help of a microinjector, the needles are inserted gently into the posterior end of the embryos and a small volume of the CRISPR mixture is dispensed. When the embryos are hatched, the larvae are checked under the fluorescent scope, and the pupae are sex-sorted and separated in different cages. Once the adults emerge, these are reciprocally crossed with wild-type individuals, blood-fed, and placed for egg laying. Once these eggs are hatched, the fluorescent larvae collected represent individuals with stable insertion of the DNA cassette into their genome. These larvae are then grown to the adult stage, outcrossed to wild-type individuals, and then further assessed through molecular techniques to confirm that the exact sequence of the DNA cassette is present at the desired site of the mosquito genome. Homozygous lines can also be obtained by following the provided pipeline of crossing schema and molecular screening of the mutations.

Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology.

Sarı Humma Sivrisineği Aedes aegypti'de CRISPR-Cas9 Kullanılarak Genom Düzenleme

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Zika Virüs Bulaşıcı hücre kültürü sistemine ve<em&gt; İn Vitro</emİnterferonların&gt; profilaktik etkisi

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Yeni Bir Dünyadan Rekombinant Virüsün Kurtarılması ve Karakterizasyonu Zika Virüsü Bulaşıcı Klon

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought serious public safety concerns. Among the risk factors, antibody-dependent enhancement (ADE) poses the most significant threat, as the recent re-emergence of the Zika virus (ZIKV) is primarily in areas where the population has been exposed and is in a state of pre-immunity to other closely related flaviviruses, especially dengue virus (DENV). Here, we describe a protocol for quantifying the effect of human serum antibodies against DENV on ZIKV infection in primary human cells or cell lines.

We describe a method to evaluate the effect of pre-existing immunity against dengue virus on the Zika virus infection by using human serum, primary human cells, and infection quantification by quantitative real-time polymerase chain reaction.

Antikor-bağımlı donanýmýn birincil insan hücrelerinde Zika şunun miktar

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

Yetişkin Sivrisineklerde Oral Beslenme ve Mikroenjeksiyon ile Deneysel Viral Enfeksiyon

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, chikungunya and Zika. Wolbachia-infected mosquitoes can be released into the field to either reduce population sizes through incompatible matings or to transform populations with mosquitoes that are refractory to virus transmission. For these strategies to succeed, the mosquitoes released into the field from the laboratory must be competitive with native mosquitoes. However, maintaining mosquitoes in the laboratory can result in inbreeding, genetic drift and laboratory adaptation which can reduce their fitness in the field and may confound the results of experiments. To test the suitability of different Wolbachia infections for deployment in the field, it is necessary to maintain mosquitoes in a controlled laboratory environment across multiple generations. We describe a simple protocol for maintaining Ae. aegypti mosquitoes in the laboratory, which is suitable for both Wolbachia-infected and wild-type mosquitoes. The methods minimize laboratory adaptation and implement outcrossing to increase the relevance of experiments to field mosquitoes. Additionally, colonies are maintained under optimal conditions to maximize their fitness for open field releases.

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia are being released into natural populations to suppress the transmission of arboviruses. We describe methods to rear Ae. aegypti with Wolbachia infections in the laboratory for experiments and field release, taking precautions to minimize laboratory adaptation and selection.

Aedes aegypti sivrisinek enfekte Wolbachia ile bakımını yapma

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Biyoloji

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus particles are transmitted during a blood meal via the saliva of an infected mosquito. Forced salivation assays allow determining the vector potential on the basis of single mosquitoes, avoiding the use of animal experiments. The method is suitable to analyze a large number of mosquitoes in one experiment within a short period of time. Forced salivation assays were used to analyze 856 individual mosquitoes trapped in Germany, including two different Culex pipiens pipiens biotypes, Culex torrentium as well as Aedes albopictus, which were experimentally infected with Zika virus (ZIKV) and incubated at 18 &#176;C or 27 &#176;C for two and three weeks. The results indicated the lack of vector competence of the different Culex taxa for ZIKV. In contrast, Aedes albopictus was susceptible to ZIKV, but only at 27 &#176;C, with transmission rates similar to an Aedes aegypti laboratory colony tested in parallel.

For efficient control of mosquito borne virus transmission, the knowledge of the vector potential of respective mosquitoes is of particular interest. We describe forced salivation as a method to analyze vector competence of Aedes albopictus and three different Culex taxa for the transmission of Zika virus.

Salya vektör yetkinlik sivrisinek analiz etmek için bir yöntem olarak zorla

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

Using the Fluorescent Dye, Rhodamine B, to Study Mating Competitiveness in Male Aedes aegypti Mosquitoes

The success of sterile or incompatible insect technique-based population suppression programs depends on the ability of released males to compete for wild-type females and induce sterility in the target population. Hence, laboratory assessment of male mating competitiveness is essential for evaluating the release strain&#8217;s fitness before field release. Conventionally, such an assay is performed by determining the proportion of viable eggs produced by the females after being simultaneously exposed to two sets of males (wild-type and release strains) for copulation. However, this process is time-consuming and laborious due to the need to first blood-feed the females for egg production and then hatch and enumerate the hatched eggs to determine egg viability.&#160;
Moreover, this method cannot discern the degree of competitiveness between two sterile or Wolbachia-infected mosquito lines as wild-type female mosquitoes will only produce non-viable eggs upon mating with both. To circumvent these limitations, this paper describes a more direct method of measuring male mosquito mating competitiveness in laboratory settings using the fluorescent dye, rhodamine B (RhB), which can be used to mark males by feeding them in sucrose solution containing RhB. After the mating assay, the presence of fluorescing sperms in the spermathecae of a female can be used to determine her mating partner. This method is cost-effective, reduces the experimental time by 90% and allows comparison of mating fitness between two sterile or Wolbachia-infected lines.&#160;

Using the Fluorescent Dye, Rhodamine B, to Study Mating Competitiveness in Male Aedes aegypti Mosquitoes

Here, we present a protocol for studying mating competitiveness of male Aedes aegypti using fluorescent dye as a marker. Female mosquitoes are exposed to both marked and unmarked males for copulation. Post mating, their spermathecae are examined under a fluorescence microscope to determine their mating partner.

Erkek Aedes aegypti Sivrisineklerinde Çiftleşme Rekabet Gücünü Incelemek için Floresan Boyası Rhodamine B'yi Kullanmak

The success of sterile or incompatible insect technique-based population suppression programs depends on the ability of released males to compete for ...

Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two main categories of these new mosquito-associated viruses are &#34;mosquito-borne viruses (MBVs)&#34; and &#34;mosquito-specific viruses (MSVs)&#34;. These novel viruses might be pathogenic to both vertebrates and mosquitoes, or they could just be symbiotic with mosquitoes. Entity viruses are essential to confirm the biological characters of these viruses. Thus, a detailed protocol has been described here for virus isolation and amplification from field-collected mosquitoes. First, the mosquito samples were prepared as supernatants of mosquito homogenates. After centrifugation twice, the supernatants were then inoculated into either mosquito cell line C6/36 or vertebrate cell line BHK-21 for virus amplification. After 7 days, the supernatants were collected as the P1 supernatants and stored at -80 &#176;C. Next, P1 supernatants were passaged twice more in C6/36 or BHK-21 cells while the cell status was being checked daily. When cytopathogenic effect (CPE) on the cells was discovered, these supernatants were collected and used to identify viruses. This protocol serves as the foundation for future research on mosquito-associated viruses, including MBVs and MSVs.

Numerous novel virus-like sequences have been found in mosquitoes due to the extensive use of sequencing technologies. We provide an effective procedure for isolating and amplifying viruses using vertebrate and mosquito cell lines, which might serve as the basis for future studies on mosquito-associated viruses, including mosquito-borne and mosquito-specific viruses.

Sahada Toplanan Sivrisineklerden Sivrisinek İlişkili Virüs İzolasyonu

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two ...