Bu protokol eski bir teknik için yeni bir yöntem sağlar ve çok sayıda temel bilim araştırmacısı için yeni bir yaklaşım sağlar. Bu tekniğin en önemli avantajları, daha geniş bir bilimsel kitle tarafından kullanılmak üzere uygun maliyetli doğasının yanı sıra adaptasyonudur. Bir geçiş plakası hazırlamak için, 48 kuyu plakasının her bir kuyunun arkasına bir çizgi çizmek ve her kuyuyu üç ayrı ilgi alanına bölmek için üç karma işaret çizmek için açık renkli kalıcı bir işaretleyici kullanın.
Daha sonra plaka 1.5-iki kez 10 dördüncü tek geçit kardiyak fibroblastlar her kuyu ve kültür normal kültür koşulları altında hücreleri 24-48 saat boyunca onlar% 90-95 biraraya ulaşana kadar. Hücreler hazır olduğunda, her kuyudan supernatant çıkarın ve çizilen çizgiler boyunca bir geçiş çizik yapmak için steril bir P200 pipet ucu kullanın. Herhangi bir bekar kardiyak fibroblastlar kaldırmak ve her iyi düşük serum orta 500 mikrolitre eklemek için düşük serum orta ile kuyuları durulayın.
Farmakolojik ajanlar kullanılıyorsa, uygun kuyulara ajanları ekleyin. Daha sonra, çizilen çizginin üst yarısının görüntülenmesi için her bir iyi konumlandırmak için işaretleri kullanarak iyi başına iki sıfır saat görüntüleri yakalamak için 20x hedefi ile ters bir mikroskop kullanın. Daha sonra ikinci görüntüyü toplamak ve 24 saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesinde plaka yerleştirmek için görünümüne çizilmiş çizginin alt yarısını konumlandırmak için plaka hareket ettirin.
Kuluçka sonunda, steril olmayan PVS ile her iyi yıkayın ve bir duman başlık her kuyuya% 4 paraformaldehit 500 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika sonra, her iyi yıkama başına beş dakika taze PBS her iyi üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca iyi ve nazik sallanan başına permeabilizing çözeltisi 300 mikrolitre ile hücreleri permeabilize.
Kuluçka sonunda, oda sıcaklığında hafif sallanan bir 10 dakikalık kuluçka için% 1 Kumasi parlak mavi leke ile permeabilizing çözeltisi değiştirin. PBS'de üç, beş dakikalık yıkıntılar ve sallandı. Son yıkamadan sonra, her kuyuya 300 mikrolitre PBS ekleyin ve plakayı sıfır saat görüntüsüyle aynı pozisyonda dikkatlice konumlandırın ve her iki 24 saatlik görüntüyü yakalayın ve gösterin.
Denemenin sonunda, görüntüleri ve uygun bir görüntüleme analizi yazılım programını açın ve sıfır saat görüntüsünde yeni bir katman oluşturun. Yeni katman satır katmanının adını değiştirmek ve fırça aracını seçmek için çift tıklatın. Piksel boyutunu 10,rengi kırmızıya çevirin ve çiziyi anahatlamak için iki ayrı çizgi çizin.
Çizgiler herhangi bir hücreye dokunmamalıdır. Görüntüleme yazılımındaki 24 saatlik görüntüyü açın ve taşıma aracını seçin. Denetim düğmesini basılı tutarak, hem satırları hem de arka plan katmanlarını tıklatın, sıfır saat görüntüsünün ortasına tıklayın ve her iki katmanı da 24 saatlik görüntünün ortasına sürükleyin.
24 saatlik görüntüde, sıfır saat arka plan katmanını tıklatın ve opaklığı %50'ye değiştirin denetim düğmesini basılı tutun, hem sıfır saat arka plan ve çizgi katmanlarını tıklatın hem de katmanları serbest dönüştürmeyi serbest dönüştürmeyi serbest dönüştürmek için düzenle ve serbest dönüştürmeyi tıklatın, sıfır saat arka plan ve çizgi görüntülerini 24 saatlik arka plan görüntüsüne hizalayın, böylece alan geçiş çizgileri 24 saatlik görüntüde doğru şekilde konumlandırılır. Satır katmanı başarıyla üzerine atıldığında, sıfır saat arka plan katmanını silmek için sağ tıklatın. Kalan satır katmanı, 24 saat içinde çizilme alanına geçirilen hücrelerin sayısını belirlemek için kullanılabilir.
Ardından yeni geçiş görüntüsünü hem Photoshop hem de TIFF veya JPEG dosyası olarak kaydedin. Geçiş yapan hücrelerin sayısını ölçmek için, geçiş görüntüsünü ve TIFF veya JPEG dosyalarını kabul eden bir programı açın ve arada bulunan ve her iki görüntü için her iki görüntü için iki kırmızı çizgiye dokunmaarasında bulunan hücre sayısını el ile sayın. Ardından görüntü başına geçirilen hücrelerin sayısını kaydedin.
Geçiş alanını belirlemek için, görüntüleme yazılımındaki geçiş çizgilerini içeren 24 saatlik görüntüyü açın ve görüntüyü geçiş alanı görüntüsü olarak kaydedin. Kaydolduktan sonra arka plan katmanını tıklatın ve katmanı silmek için sağ tıklatın. Çizilme çizgileri arasındaki alanı, çizgiler için kullanılan renkle doldurmak için fırça aracını kullanın ve görüntüyü siyah beyaza değiştirmek için görüntü, mod ve gri ölçeği tıklatın.
Görüntüyü kaydedin ve geçiş alanı görüntüsünü ve uygun bir görüntü analizi yazılım programını açın. Edit'i tıklatın ve ters çevirin. Geçiş satırının alanını belirlemek için görüntü, ayarlama ve eşiğe tıklayın.
Siyah geçiş alanı kırmızıya döner ve yüzde alanı eşik kutusunda gösterilir. Ardından, geçiş satırı için yüzde alanını kaydedin ve bu değerin aynı görüntü için geçirilen hücre sayısıyla eşlendiğini onaylayın. Bu analizde, 24 saatlik deneysel zaman diliminde diyabetik olmayan kalplerden 46 fibroblast ve diyabetik kalplerden 129 fibroblast göç etmiştir.
Göç alanının gösterildiği gibi ölçülmesi, diyabetik olmayan çizilme alanının ölçülen toplam alanın %24,78'ini, diyabetik göç çizik alanının ise ölçülen toplam alanın %16,77'sini oluştuğunu ortaya koymuştur. Göç alanına normalleştirme hücre göçünün daha iyi ve daha titiz bir değerlendirmesini sağlar ve potansiyel insan hatasını inkâr eder. Örneğin, yalnızca göç eden fibroblast sayısı karşılaştırılırsa, bu analizde bu kuyuya göç eden hücre sayısının ikinci kuyudaki göç eden hücrelerin iki katı olduğu ortaya çıkar.
Ancak verileri normalleştirmek için çizilme alanı kullanıldığında, fibroblastların göç alanına oranının her iki kuyuda da hemen hemen aynı olduğu gözlenmiştir. Sıfır saat görüntüsünde yakaladığınız gibi, 24 saatlik görüntüdeki geçiş alanını yeniden yakaladığınızdan emin olun. Bu işlemden sonra, immünohistokimya hücreleri içinde protein ekspresyonu incelemek için yapılabilir.
Sıfırdan göç tadına yönelik bu yeni yaklaşımın, daha önce mevcut olmayan daha fazla bilimsel araştırma nın açılmasına olanak sağlayacağına inanıyoruz.
