Bu protokol rekombinant rotavirüsler yapmak için güvenilir ve verimli bir ters genetik sistemi açıklar. Ayrıca floresan marker proteinleri ifade rekombinant rotavirüsler yapmak nasıl açıklar. Bu yöntem plazmidlerin az sayıda gerektiren basit ve ayrı flor proteinleri yanı sıra viral proteinler ifade rekombinant rotavirüsler üretebilir.
BHKT7 hücrelerini 12 kuyulu plakalara tohumlayarak başlayın. PBS ile hücrelerin taze enfluent monolayer durulayın. Daha sonra tripsin-EDTA çözeltisi ile monolayer bozun ve GMEM tam orta beş mililitre hücreleri resuspend.
Trypan mavisi ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak canlı BHKT7 hücrelerinin konsantrasyonu belirleyin. Daha sonra 12 kuyulu hücre kültür plakasının her kuyunun içine bir mililitre GMEM'deki beşinci hücrelere iki kez 10 tohum koyun. Plakayı bir gecede %5 karbondioksit kuvözde 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Ertesi gün, el yazması yönlere göre transfeksiyon için plazmid karışımı nı hazırlayın. Daha sonra her plazmid karışımına önceden ısıtılmış azaltılmış serum ortamının 110 mikrolitresini ekleyin ve hafifçe karıştırmak için pipet yukarı ve aşağı. Karışıma 32 mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin.
Girdap ve 20 dakika oda sıcaklığında kuluçka aşağıdaki kısa bir santrifüj yapın. Bu arada, Iki mililitre GMEM eksik orta bhkt7 hücreleri durulayın. Her kuyuya bir mililitre eksik Orta SMEM ekleyin ve plakayı kuvöze geri verin.
20 dakikalık kuluçkadan sonra, transfeksiyon karışımını her kuyuya damla damla eklemek için 200 mikrolitrelik pipettor kullanın. Yavaşça plakayı sallayın ve kuvöze geri ver. Transfeksiyondan iki gün sonra, MA104 hücrelerinin yeni bir monokatmanını PBS ile durulayın.
Tripsin-EDTA çözeltisi ile monolayer bozun ve DMEM tam orta beş mililitre hücreleri yeniden askıya. Hücreleri sayın ve konsantrasyonu dMEM'in mililitresi başına beşinci hücrelere sekiz kez 10'a ayarlayın. Transfected BHKT7 hücreleri ile kuyulara damla akıllıca MA104 hücrelerinin 0.25 mililitre ekleyin.
Tripsin konsantrasyonunu her kuyuya mililitre başına bir miligrama 0,8 mikrolitre ekleyerek mililitre başına 0,5 mikrograma ayarlayın. Kalan MA104 hücrelerini DMEM'deki mililitre başına beşinci hücrelere 1,5 kat 10 konsantrasyonla seyreltin ve altı kuyulu bir plakanın her kuyuya iki mililitre yerleştirin. Transfeksiyondan altı gün sonra, transfected hücrelerden rekombinant virüsü kurtarmak.
BHKT7 MA104 hücrelerini steril koşullar altında üç döngü donma/çözülme ye tabi tarak plakaları negatif 20 santigrat derecelik bir dondurucu ile oda sıcaklığı arasında hareket ettirin. Lysates'i 1,5 mililitrelik tüplere aktarın. Tüpleri 500 kez g ve hücresel enkazı peletlemek için 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin.
Supernatant toplamak ve dört santigrat derece saklayın. 100 mikrolitre açıklıklı hücre lysate'ye tripsin ekleyin ve mililitre başına 10 mikrogramlık son konsantrasyona ekleyin ve karışımı bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra 10 ila 10 arasında değişen bir seri seyreltme serisi hazırlamak 10 için negatif bir için 10 dmem eksik ortamda negatif yedi.
MA104 monolayers iki mililitre PBS ve bir kez DMEM eksik orta ile iki kez durulayın. Plakalara 400 mikrolitre lysate seyreltme ekleyin ve 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit le kuluçkaya yatırın, seyreltmeleri tek kata dağıtmak için her 10 ila 15 dakikada bir sallayın. Eşit hacimlerde önceden ısıtılmış 2X EMEM ile %1,5 erimiş ve soğutulmuş agarose'u birleştirerek bir agarose MEM kaplama çözeltisi hazırlayın.
Bu çözeltiyi bir su banyosunda 42 santigrat derecede koruyun ve tripsin konsantrasyonu hücrelere yerleştirmeden hemen önce mililitre başına 0,5 mikrograma ayarlayın. Altı kuyulu plakadan seyreltmeler aspire edin. Daha sonra hücreleri iki mililitre eksik orta ile bir kez durulayın.
Yavaşça her kuyuda hücre monolayer üzerine agarose MEM kaplama çözeltisi üç mililitre ekleyin. Agarose oda sıcaklığında sertleşmeye izin verin. Sonra plakaları kuvöze geri ver.
Üç gün sonra, daha önce açıklandığı gibi bir agarose MEM kaplama çözeltisi hazırlayın ve kullanımdan hemen önce mililitre başına 50 mikrogramlık son konsantrasyona nötr kırmızı ekleyin. Altı kuyu plakalar mevcut agarose üstüne bindirme çözeltisi iki mililitre ekleyin. Agarose sertleştirmek ve kuvöz plaka dönmek için izin, ışık nötr kırmızı plakaları korumak için emin olun.
Önümüzdeki altı saat içinde, bir ışık kutusu yardımıyla rotavirüs plakları belirlemek. Hücre tabakasına kadar uzanan agarose fişleri geri kazanarak, net bir şekilde tanımlanmış plakları almak için tek kullanımlık transfer pipetleri kullanın. 0,5 mililitre DMEM eksik orta ve girdap içeren 1,5 mililitrelik bir tüp içine fişi 30 saniye boyunca çıkarın.
MA104 monolayers veya DMEM eksik orta ve tripsin mililitre başına 0,5 mikrogram at25 şişesi üzerinde yayılım tarafından orta eluted plak izole virüs yükseltmek. 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüpleriçine 600 mikrolitre açıklık enfekte hücre litates ve guanidinium tiyosiyanat 400 mikrolitre ekleyin. 30 saniye boyunca girdap ve beş dakika oda sıcaklığında onları kuluçkaya yat.
Sonra kloroform 200 mikrolitre ekleyin. 30 saniye boyunca çözeltiyi girdap ve üç dakika kuluçkaya yatırın. 13, 000 kez g ve dört santigrat derece de beş dakikalık bir mikrosanrifugation sonra, taze bir tüp içine üst sulu faz 550 mikrolitre aktarın.
Soğuk isopropil alkol iki cilt ekleyin ve tüp ters dört ila altı kez. Numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra 13, 000 kez g ve dört derece santigrat 10 dakika santrifüj.
RNA peletini bırakarak süpernatant'ı atın. RNA'yı bir mililitre 75 etanol ekleyerek bir kez ters çevirerek ve 7, 500 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj ederek yıkayın. Etanol'ü dikkatlice çıkardıktan sonra RNA'nın 5 ila 10 dakika boyunca kurumasını bekleyin.
Daha sonra peleti 15 mikrolitre çekirdeğin serbest suyunda eritin. Çözünmüş RNA örneğinin 10 mikrolitresine iki mikrolitre 6X DNA yükleme tamponu ekleyin. Önceden dökme%10 poliakrilamid mini jel üzerine yükleyin.
Tris-glisin çalışan tampon elektroforez ile RNA'lar sabit bir 16 miliamper akım altında iki saat boyunca çözün. Jel çalışması tamamlandıktan sonra, mililitre ethidyum bromür başına bir mikrogram içeren suda 5 ila 10 dakika bekletin ve UV transilluminator ile rotavirüs genom segmentleri tespit. Bu ters genetik protokolü kolayca plak izolasyonu için izin MA104 hücreleri üzerinde bir plak tsay ile tespit edilebilir rekombinant SA11 virüsleri oluşturmak için kullanılmıştır.
Plak saflaştırılmış rSA11 yabani tip ve SA11-UnaG virüslerinin dsRNA genomları fenol ve guanidinium tiyosiyanat içeren bir solüsyon ile çıkarıldı, %10 poliakrilamid jel üzerinde elektroforez ile çözüldü ve etid bromür ile boyanarak tespit edildi. Beklendiği gibi, rSA11-UnaG segment ivedi veya NSP3 dsRNA 2A-3xFLUnaG dizilerinin varlığı nedeniyle rSA11 wild tipinden çok daha yavaş göç etti. UnaG floresan proteininekspresyonkontrol etmek için, MA104 hücreleri yabani tip ve rekombinant virüs ile enfekte edildi ve canlı hücre görüntüleyici ile incelendi.
Analiz, rSA11-UnaG'nin yeşil floresan ürettiğini, rSA11 yabani tipli hücrelerde floresan saptanmadı. RSA11-NSP3-2A-xflUnaG'nin 2A elementinin iki ayrı proteinin ekspresyonunu teşvik edip etmediğini araştırmak için immünoblot analizi yapıldı. Analiz, NSP3-2A ve 3xFL-UnaG'ın fonksiyonel 2A elementini gösteren ayrı proteinler olarak ifade edildiğini gösterdi.
Rekombinant rotavirüs başarılı kurtarma için, transfeksiyon ve MA104 hücreleri için kaliteli, iyi korunmuş BHKT7 hücreleri tohumlama üzerinde yanı sıra son derece saf plazmidlerin doğru miktarda kullanmak önemlidir. Bu protokol, rotavirüs NSP3 genini değiştirmek için ters genetik sisteminin nasıl kullanılacağını açıklasa da, aynı yaklaşım SP1 gibi diğer genleri değiştirmek için kullanılabilir.
