Bademcikler mononükleer hücreler kan hücrelerinden daha alakalı ve karmaşıktır ve izolasyonları mukozal bağışıklığı içeren patolojilerde bağışıklık hücresi yanıtının incelenmesine olanak sağlar. Kurduğumuz teknik, çok sayıda bağışıklık hücresinin bir mukozal dokudan kurtarılmasını sağlarken, ekstrem itimatçalışmaları için bütünlüklerini korumasını sağlar. Yöntem oldukça basittir, ancak bademcikler verimi en üst düzeye çıkarmak için hızlı ve dikkatli bir şekilde ele alınması gerekir.
El yazması metinde açıklandığı gibi insan bademcik dokusunu laboratuvara taşıyın. Daha sonra, hücre süzgeci bir 150 tarafından 25 milimetrelik kültür çanak üzerine yerleştirin. Onları steril tutmak için başka bir çanak tüm diseksiyon aletleri yerleştirin.
Tüm ana numuneleriniz daha önce kalifiye olmadıkları ve bulaşıcı ajanlar içermedikleri için özenle ele alınmalıdır. Sonra bir süzgeç içine şişeden PBS dökün, bademcikler çıkış var bazı hücreler içerecektir çünkü. Steril forceps kullanarak, steril forceps kullanarak kültür çanak içine şişe bademcikler aktarın.
Gerekirse, ızgarayı batırmak için daha fazla PBS ekleyin. Diseksiyonu bademcik başına yaklaşık 45 dakika sürer. Bu süre zarfında bademciklerin iyi canlılık ve hücre verimi sağlamak için batık olması çok önemlidir.
Forceps ve neşter kullanarak kürterize kanlı ve fibroid doku çıkarın. Neşter ve kavisli cımbız kullanarak, çapı yarım santimetreden daha az küçük parçalar halinde doku kesti. Küçük parçalar her zaman batırılmış olabilir, böylece tüm doku kesin.
Hücre süzgecine birkaç parça doku yerleştirin. Beyaz stroma sadece çok ince bir tabaka kalana kadar bir cam haşere ile ızgara üzerine kazıyın. Izgarayı tıkamamak için stroma'yı çıkarın ve atın.
Daha sonra hücre süspansiyonuna ızgaraya aktarmak ve son bir kez kazımak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın. Daha sonra, hücre süspansiyonuna steril bir şişeye aktarmak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın. Izgarayı ve hücre süzgecini pbs ile bir kez yıkayın ve PBS'yi de şişeye aktarın.
Devam etmeden önce hücre süspansiyon oda sıcaklığında beş dakika boyunca bankta dinlenmeye bırakın. Yeni bir 50 mililitrelik şişe üstüne steril 70 mikrometre elek yerleştirin. Hücre süspansiyonuna 10 mililitrelik pipetle yavaşça elek aktarın.
Elek tıkanmışsa, hücreleri elekten kazımak için steril bir mililitrelik pipet ucunun arkasını kullanın. Elek gerektiği sıklıkta değiştirin. Hücreleri 250 kez g'de 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin.
Santrifüjden sonra, supernatant atın. Şişeye hafifçe dokunarak peleti yeniden askıya alın ve 35 mililitre PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın. Hücre izolasyonunun ilk aşamasını tamamlamak için, yeni bir şişenin üzerine 70 mikrometrelik yeni bir elek yerleştirin ve hücre süspansiyonuna 10 mililitrelik pipetle aktarın.
Daha net bir hücre çözeltisi elde etmek için, yeni bir 50 mililitrelik şişeye 15 mililitre yoğunluk degradeli ortam ekleyerek başlayın. Karıştırmayı en aza indirmek için dikkatli olmak için, yoğunluk gradyan ortamın üstüne TMC çözeltisi dökün. Daha sonra, hızlanma ve fren kapalı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 1000 kez g çözeltisantrik.
Santrifüjden şişeyi çıkardıktan sonra, üst katmanı çıkarmak ve atmak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın. TMC'ler ve yoğunluk gradyan ortamı arasındaki arabirimi rahatsız etmeyin. Daha sonra steril bir mililitrelik pipet ucu ile TMC'leri çıkarın ve 50 mililitrelik yeni bir şişeye aktarın.
Hücreleri yıkamak için, ilk% 2 fetal sığır serum ve 2 milimolar EDTA içeren PBS 50 mililitre ekleyin. Sonra tüpü 250 kez g'de 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin. Hücreleri tekrar yıkayın, ama bu sefer 400 kez g dört santigrat derece 10 dakika boyunca tüp santrifüj.
RPMI 1640'ı %10 ısı yalıtımlı FBS, 2 milimolar L-glutamin ve antibiyotik çözeltisi ile tamamlayarak R10 kültür ortamını hazırlayın. TMC'leri 10 mililitre R10'da yeniden askıya alın. O zaman hücreleri say.
Hücreler ya hemen kullanılabilir ya da makalede açıklandığı gibi gelecekteki kullanım için dondurulmuş. TMC'ler boyandı, antikorlarla kuluçkaya yatırıldı ve akış sitometrisi kullanılarak karakterize edildi. TMC'ler kandan periferik mononükleer hücrelerde bulunan tüm majör immün hücre tiplerini içeriyordu, kısaltılmış PMBC.
Ancak, B hücreleri hariç tüm hücre türlerinin frekansları TBMC'lerde KİT'lere göre daha düşüktü. Sitokin üretiminde hücre aktivasyonunu incelemek için, TMC'ler requimod R848 ile bir gecede uyarıldı. TMCs, mavi çizilmiş, ifn Lambda 2/3 ve IL-8 dışında test edilen tüm sitokinler üretti, üretim PBMCs daha düşük olmasına rağmen, yeşil çizilmiş.
R848 stimülasyonunu karşılaştırarak kat artar stimülasyonu kırmızı ile belirtilir. Saflaştırılmış ve izole TMCs, mavi, ve bademcik doku blokları, turuncu, Influenza A virüsü ile 24 saat boyunca uyarıldı, IAV. IFN üretimi TMC'lerde saptandı, ancak doku bloklarının süpernatantında doku eksplandanlarının sitokin salgılanması ve hücre aktivasyonu çalışmaları için en iyi model olmadığını gösteren bir yapıda değil.
Toksik ilaç C1 ile ön kuluçka ve R848 ile stimülasyon sonra, TMCs ve PBMCs canlılık için tsayed edildi. TMC'ler C1'e karşı daha duyarlıydı. Bu, gelecekteki tedavilerde yeni ilaçların sadece hücre hatları, PBMCs veya doku eksplorleri üzerinde değil, dokulardan gelen hücrelerde test edilmesi gerektiğini göstermektedir. Bu prosedür bize tam kandan PBMCs gibi TMCs kullanmak ve belirli bir hücre tipi, hücre kültürü, akış sitometri veya donma saflaştırma gibi aynı hücresel deneyler gerçekleştirmek için izin verir.
TMC'lerin izolasyonları, mukozal bağışıklığı içeren patolojilerde sekonder lenfoid organlarda immün yanıtı ilgili bir modelde daha iyi karakterize etmeyi mümkün kılmıştır.
