Las células mononucleares tonículas son más relevantes y complejas que las células sanguíneas, y su aislamiento permite el estudio de la respuesta de las células inmunitarias en patologías que implican inmunidad a la mucosa. La técnica que hemos establecido permite la recuperación de un gran número de células inmunitarias de un tejido mumoso manteniendo su integridad para estudios ex vivos. El método es bastante sencillo, pero las amígdalas deben manejarse rápidamente y con cuidado para maximizar el rendimiento.
Transportar el tejido amigdalar humano al laboratorio como se describe en el texto manuscrito. A continuación, coloque el colador celular en un plato de cultivo de 150 por 25 milímetros. Coloque todos los instrumentos de disección en otro plato para mantenerlos estériles.
Todos sus especímenes principales deben ser manipulados con cuidado, ya que no han sido previamente calificados y pueden contener agentes infecciosos. A continuación, vierta el PBS del vial en un colador, ya que contendrá algunas células que han salidado las amígdalas. Usando fórceps estériles, transfiera las amígdalas del vial al plato de cultivo usando fórceps estériles.
Si es necesario, agregue más PBS para sumergir la cuadrícula. La disección tomará unos 45 minutos por amígdala. Es crucial que durante este tiempo las amígdalas se sumerjan para garantizar una buena viabilidad y rendimiento celular.
Retire el tejido sangriento y fibroma cauterizado usando fórceps y un bisturí. Usando el bisturí y las pinzas curvas, corta el tejido en pequeños trozos de menos de medio centímetro de diámetro. Corte todo el tejido para que las piezas pequeñas puedan sumergirse en todo momento.
Coloque algunos trozos de tejido en el colador celular. Rasparlos en la rejilla con un pestillo de vidrio hasta que sólo quede una capa muy delgada de estroma blanco. Retire y deseche el estroma para evitar obstruir la rejilla.
A continuación, utilice una pipeta de 10 mililitros para transferir la suspensión celular a la rejilla y rasparla una última vez. A continuación, utilice una pipeta de 10 mililitros para transferir la suspensión celular a un vial estéril. Lave la rejilla y el colador celular con PBS una vez, y transfiera el PBS al vial también.
Antes de continuar, deje reposar la suspensión celular en el banco durante cinco minutos a temperatura ambiente. Coloque un tamiz estéril de 70 micrómetros encima de un nuevo vial de 50 mililitros. Transfiera suavemente la suspensión celular al tamiz con una pipeta de 10 mililitros.
Si el tamiz está obstruido, utilice la parte posterior de una punta de pipeta estéril de un mililitro para raspar las células a través del tamiz. Cambie el tamiz tantas veces como sea necesario. Centrifugar las células a 250 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet tocando suavemente el vial y luego vuelva a suspender las células en 35 mililitros de PBS. Para completar la primera fase de aislamiento celular, coloque un nuevo tamiz de 70 micrómetros en la parte superior de un vial nuevo y transfiera la suspensión celular en él con una pipeta de 10 mililitros.
Para obtener una solución celular más clara, comience agregando 15 mililitros de un medio de gradiente de densidad a un nuevo vial de 50 mililitros. Vierta la solución TMC encima del medio de gradiente de densidad, teniendo cuidado de minimizar la mezcla. A continuación, centrifugar la solución a 1000 veces g durante 30 minutos a temperatura ambiente con aceleración y freno apagado.
Después de retirar el vial de la centrífuga, utilice una pipeta de 10 mililitros para extraer y desechar la capa superior. No perturbe la interfaz entre los TMC y el medio de gradiente de densidad. A continuación, retire los TMC con la punta estéril de una pipeta de un mililitro y transfiéralas a un nuevo vial de 50 mililitros.
Para lavar las células, primero agregue 50 mililitros de PBS que contengan 2%suero bovino fetal y 2 EDTA milimétricas. A continuación, centrifugar el tubo a 250 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Lave las células de nuevo, pero esta vez centrifugar el tubo a 400 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Preparar el medio de cultivo R10 complementando RPMI 1640 con 10%FBS inactivado por calor, 2 mililitros de L-glutamina y la solución antibiótica. Vuelva a suspender los TMC en 10 mililitros de R10. Luego cuenta las células.
Las celdas se pueden utilizar inmediatamente o congelarse para su uso futuro como se describe en el manuscrito. Los TMC se tiñeron, se incubaron con anticuerpos y se caracterizaron mediante citometría de flujo. Los TMC contenían todos los principales tipos de células inmunitarias presentes en las células mononucleares periféricas de la sangre, abreviado PMBC.
Sin embargo, las frecuencias de todos los tipos de celda, excepto las células B, eran más bajas en los TMC que en los PBMC. Para estudiar la activación celular en la producción de citoquinas, los TMC se estimulan durante la noche con el resiquimod R848. Los TMC, trazados en azul, produjeron todas las citoquinas probadas excepto IFN Lambda 2/3 e IL-8, aunque la producción fue inferior a la de los PBMC, trazadas en verde.
El pliegue aumenta comparando la estimulación R848 con ninguna estimulación se observan en rojo. Los TMC purificados y aislados, azules y tonsillares, de color naranja, se estimularon durante 24 horas con el virus de la gripe A, IAV. La producción de IFN se detectó en los TMC, pero no en el sobrenadante de los bloques tisulares, lo que indica que los explantes de tejidos no son el mejor modelo para el estudio de la secreción de citoquinas y la activación celular.
Después de la pre-incubación con el fármaco tóxico C1 y la estimulación con R848, se ensayaron TMCs y PBMC para su viabilidad. Los TMC eran más sensibles al C1. Esto sugiere que los nuevos medicamentos en futuros tratamientos deben probarse en células de tejidos, no solo en líneas celulares, PBMC o plantas de tejidos. Este procedimiento nos permite utilizar los TMCs como LOS PBMC de sangres enteras y realizar los mismos experimentos celulares como la purificación de un tipo celular específico, el cultivo celular, la citometría de flujo o la congelación.
Los aislamientos de los TMC permiten caracterizar mejor, en un modelo relevante, la respuesta inmunitaria en órganos linfoide secundarios en patologías que implican inmunidad a la mucosa.
