Bu protokol, akut kardiyak toksisite testi ve kalp yetmezliği tedavilerinin etkinliğini test etmek için kullanılabilecek fizyolojik koşullar altında altı gün boyunca kalp dokusu kesiti ve kültüre alınması içindir. Bu kültür sistemi, klinik öncesi ve klinik test sonuçları arasındaki boşluğu kapatan akut kardiyak toksisite testi için yerinde güçlü bir tahmine sahip insan olma potansiyeline sahiptir. Prosedürleri gösteren Qinghui Qu, bizim laboratuvar dan bir laboratuvar yöneticisi olacaktır.
Domuz kalp doku dilimleri elde etmek için, ilk bir vibratom doku banyosu soğutma ceket buz ekleyin ve banyo ya Tyrode çözüm ekleyin. Doku banyosu soğutma ceket erimiş buz runoff toplamak ve bir biyogüvenlik kabine taze soğuk kardiyoplejik çözüm bir litre içeren bir tepsiye domuz kalbi aktarmak için bir litre plastik kavanoz kullanın. Sol ventrikül izole etmek için kalp incelemek ve bir ila iki küp santimetre bloklar halinde sol ventrikül kesmek için dikdörtgen jilet kullanmak için geri çekilebilir steril neşter kullanın.
Dilimleme için bir doku bloğu kenara koyun ve buz üzerinde soğuk Tyrode çözeltisi 50 mililitrelik tüp içine kalan doku bloğu parçaları yerleştirin. Yavaşça ayrılmış doku bloğu masaj ve vibratom metal örnek tutucu doku tutkal bir ila iki damla ekleyin. Tutkal yaklaşık bir santimetre kare bir yüzey alanı ile% 4 agar blok bir parça sopa ve agar doku tutkal bir ila iki damla ekleyin.
Agar kardiyak epikardiyan tarafına kalp bloğunu mümkün olduğunca tutucuya karşı düz olarak doku ile aşağı takın ve kalp bloğu ile doku tutucuyu vibratomun dilimleme banyosuna yerleştirin. Bu doku tutkal aşağı bakan kardiyak epikardi tarafı ile agar için kalp bloğu sopa ve doku mümkün olduğunca düz olduğundan emin olmak için çok önemlidir. Daha sonra oksijen tüpünü dilimleme banyosuna ve Tyrode çözeltisi ile dolu metal tepsiye takın ve 40 mikrometrelik hücreli süzgeci, dilimlenirken kalp doku bölümlerini toplamak için metal tepsiye yerleştirin.
Bıçağın yüksekliğini ayarlamak için vibratom işletim yazılımını kullanın ve bıçağın üst kısmına yakın, ancak papiller kasların ve sıvının altında dokuyu ve bıçağı kaplar. Dokuyu dilimlemeye başlayacağınızı ayarlamak için önceden seçin. Hızı artırmak için dilime basın ve bıçağı dokunun kenarına doğru hareket ettirmek için düğümü kullanın.
İşlemi durdurmak ve ilerlemek için dilime tekrar basın. Daha sonra belirtilen kesme parametrelerini ayarlayın ve dokuyu dilimleme başlamak için dilime basın. Bıçak dokunun ucuna ulaştığında ancak numune tutucunun ucuna çarpmadan önce, durdurmak için tekrar dilime basın ve başlangıç pozisyonuna geri dönmek için geri dönmek için geri dönün.
Dilimler tam uzunluğa ulaştığında ve kaliteli görünüyor, hafifçe forseps ve yay makas kullanarak banyodan doku toplamak için soğuk Tyrode çözeltisi ile dolu plastik bir Pasteur pipet kullanın gerektiği gibi kalpten dilim yerinden çıkarmak için. Toplanan her dilimi oksijenli Tyrode banyosunda tek bir hücresüze yerleştirin ve gazın içinde solüsyonu kullanarak hücre süzgeci yüzeyindeki dokuya basın. Sonra onu tutmak için dokunun üstüne metal bir yıkayıcın yerleştirin.
Oksijenli Tyrode çözeltisinde en az bir saat kaldıktan sonra, her dilimin dışını kırparak pürüzlü kenarları çıkarın ve her dilimin ucunu gömülü metal tellerle altı milimetre genişliğindeki sterilleştirilmiş poliüretan yazıcı zamanlama kayışına yapıştırın. Desteklenen kalp dilimlerini kuyu başına altı mililitre kültür ortamı içeren altı kuyulu tabaklara yerleştirin ve dokunun kuyunun merkezinde olduğundan emin olmak için steril çalgılar kullanın. Plaka kapağının dokuya değmemeyenve plakakapağının kavisli tarafının plakanın açılı tarafıyla eşleşip kare köşelerin hizaya girebilen kültür plakasına yerlebir edilebiyi göz önünde bulundurun.
Dilimleri 37 derece santigrat ve %5 karbondioksit kuvöze yerleştirin. Günde üç kez altı mililitre taze oksijenli kültür ortamı ile kültür supernatants değiştirin. Kapağı hücre kültürü elektrik seladamasına bağlayın ve uyarıcıyı ayarlayarak kalp dilimlerine 10 volt elektrik ve 1,2 hertz frekansı teslim edin.
Stimülasyon taktıktan sonra, kalp dilimleri atmaya başlar. Her gün öğle nisbi ortam değişimi sırasında, kültür ortamına toksik grafit parçacıkların salınımını önlemek için kültür çanasından uyarım plakası kapağını değiştirin. Kullanılan kapağın hücre kültürü elektrik uyarıcısının kabloya bağlandığı beyaz köpük fişi takın ve plaka kapağını 2X antibiyotik/antimikotik ile takviye edilmiş otoklavlı su banyosuna yerleştirin.
Ertesi gün, üç dakika boyunca 2X antibiyotik / antimycotic ile desteklenen taze bir otoklavlı su banyosu içine kapak aktarmadan önce beş ila 15 dakika boyunca bir 70% etanol banyosu nda plaka kapağı dekontamine. Plaka kapağını duruladıktan sonra, plastik parçalardan kalan suyu çıkarmak ve beyaz köpük fişini çıkarmak için etanol püskürtülen temiz tiftiksiz bir mendil kullanın. Kapak daha sonra kültür plakasına geri yerleştirilmesi için hazırdır.
Gösterildiği gibi bu yeni biyomimetik kültür kurulum kullanılarak, domuz kalp dilimleri canlılık MTT tsay tarafından değerlendirildiği gibi altı gün boyunca muhafaza edildi. İlk altı gün içinde, taze kalp dilimleri için gözlenen tepkiler benzer, domuz kalp dilimi kardiyomiyositiçinde hiçbir spontan kalsiyum geçici vardır. Kardiyomiyositler dış elektriksel ve beta-adrenerjik stimülasyona yanıt verdi.
Buna ek olarak, kontraktil kuvvet ve izoproterenol yanıtları kadar altı gün taze kalp dilimleri gözlenen benzer kalp dilimi kültüründe muhafaza edildi. MTT canlılık tahlilleri, immünboyama, elektron mikroskobu, kalsiyum geçici ölçümleri, kontraktil fonksiyon değerlendirmeleri, metabolik değerlendirmeler ve analiz dahil olmak üzere kalp dilimleriüzerinde çeşitli yapısal ve fonksiyonel değerlendirmeler yapılabilir. Şu anda akut kardiyak toksisite ve ilaç ve domuz ve insan kalp dilimleri ilgi gen tedavileri etkinliğini test etmek için bu kültür sistemini kullanıyoruz.
