Burada belirli bir beyin bölgesinin genetik stimülasyon ödüllendirici veya aversive özelliklerini değerlendirmek için ayrıntılı bir protokol sağlar. Belirli hücrelerin uyarılması ödüllendirici veya aversive ise teknik hızla cevap verebilir. Ventral tegmental alanı uyarmak için kurulum tarif ama protokollerimiz kolayca farklı bölgeler açısından belirli parametreleri değiştirmek için adapte edilebilir okudu.
Başlamak için, lazer kaynağını kontrol etmek için tek kartlı mikrodenetleyiciler kullanın. Bilgisayara uygun bağlantı kablosunu kullanarak komut dosyasını mikrodenetleyici panosuna yükleyin. Komut dosyası, izleme yazılımından bir TTL kutusu aracılığıyla gelen dış modülasyon ve stimülasyon parametrelerini kontrol etmek için lazere bir çıkış içerir.
TTL kutusunu tahtaya bağlamak için bir ağ kablosu kullanın. Lazerin harici modülasyon la kontrol edilebilmesi için ayarlandığından emin olun ve lazeri FC/PC kablosu kullanarak tahtaya bağlayın. Uygun pimleri tahtanın zemin parçalarına bağlayın.
Lazer kaynağını optik fibere bağlamak için, önce lazer kaynağını döner bir derkiye bağlayın. Bir yama kablosunu döner derkiye bağlayın. Döner dergiyi cihazın üzerinde, ancak kayıt alanının dışında sabitle.
Fiber optik yama kablosunun uzunluğunun, farenin arenada zorluk olmadan hareket etmesine izin vermek için uygun olduğundan emin olun. Arena kurulumayarlamak için, fiziksel cihazın belirli bir bölümünü ölçmek için bir cetvel kullanın. Yazılımda, ölçülen parçaya karşılık gelen bir çizgi çizin.
Kalibrasyon sekmesine Ayarla Ölçeği'nin altında, zaten bilinen değeri girin. Arenayı tasarla, farelerin hareketinin kaydedeceği alanı çiz. Bölgeleri oluşturun, sonunda lazer eşli, lazer leeşmemiş ve nötr olarak atanacak bölgeleri çizin.
Örneğin, arenanın dışındaki bölgeler gibi çakışan bir parametre olmadığını doğrulamak için kurulumu doğrulamak için Kurulumu Doğrula düğmesine basın. Donanım denetiminin etkin olduğundan emin olun ve denemenin saatini başvuru kutusu ayarlarındaki yineleme til seçeneğine göre 30 dakika olarak ayarlayın. Faregirişinin izleme yazılımı aracılığıyla mikrodenetleyici panosuna koşul ayarları altında TTL sinyalini tetikleyeceği lazer eşli olarak bir bölme atayın.
Nötr bölme tercihi yaklaşımının kurulumunu değiştirmek için, arena ve zaman kurulumundan sonra, a ve b bölmelerinin ayarlarıyla ilgili koşul kutusu için merkez noktası A ve bölge B'den herhangi birinde yken eklenerek hem A hem de B bölgelerini lazer le eşlenmiş olarak atayın. Algılama ayarlarını ayarlamak için fareye benzemek için bir kukla kullanın. Kuklayı aygıtın bir bölmesine yerleştirin ve dinamik çıkarma ile otomatik kurulum kullanın.
Kuklayı çıkarın ve karşı bölmeye yerleştirin. Kuklanın tam olarak tespit edildikinden emin ol. Kuklayı lazerle eşleştirilmiş bölmeye yerleştirin.
Uyarım işe yarayıp yaramadığını kontrol etmek için, önceden yapılandırılmış deneme denetimi ayarlarını kullanarak edinmeye başlayın ve uyarımın olması gerektiği gibi tetiklenip tetiklenmeyişe bak. Daha sonra mankeni eşleşmemiş veya nötr bölmeye yerleştirin ve uyarımDurdurulup durdurulmamadığına bakın. Lazer gücünü 10 miliwatt'a ayarlamak için lazerin üzerindeki bilemiyi kullanın.
Fiber optik implantı seramik bir kılıf kullanarak fiber optik yama kablosuna bağlayın ve fareyi üç bölmeli aparatın nötr bölmesine yerleştirin. Fare yazılım tarafından algılanana kadar bekleyin. Hayvanın ana bölmelere girmesini kısıtlayan dikey sürgülü kapıları çıkarın.
Hayvanın herhangi bir rahatsızlık duymadan özgürce keşfetmesine izin verin. Tüm gerçek zamanlı yer tercihi denemesi sekiz oturum boyunca gerçekleşir. Ventral tegmental bölgede AAV channelrhodopsin EYFP virüsü enjekte edilen DAT-Cre farelerdopaminerjik nöronları hedef almak için test edildi.
Fareler, %20'lik eşleşmez bölmenin ve %10'luk nötr kompartmanın aksine, zamanlarının ortalama %70'ini ventral tegmental bölgede AAV channelrhodopsin EYFP enjekte edilen Vglut2-Cre farelerile gözlenmiştir. Fareler, stimülasyonla eşleşen bölmeden kaçındı ve eşleşmemiş bölmede daha fazla zaman geçirdi. Koşullu tepkiler gün beş ve sekiz sırasında, fareler daha önce eşleştirilmiş bölmesi net bir kaçınma göstermedi.
Belirli nöronların ödüllendirici veya aldatıcı rolünü daha fazla göstermek için, açıklanan yöntem operon paradigmaları veya fotogenetik substimülasyon gibi diğer yöntemlerle iltifat edilebilir. Virüsleri kullanırken ve lazer kaynaklarını kullanırken dikkat edin.
