Staphylococcus aureus patogenezi teşvik virülans faktörleri geniş bir yelpazede üreten bir gram-pozitif bakteridir. Bunlar arasında pmn veya nötrofil olarak da adlandırılan polimorfonükleer lökositlerin membran bütünlüğünü bozan iki bileşenli lökotoksinler yer almaktadır. Bu video, pmn'lerin insan tam kanından izolasyonunu ve bu önemli doğuştan gelen bağışıklık hücrelerine karşı S.aureus sitotoksisitesini ölçmek için iki ayrı tahlili göstermektedir.
Bu tahliller tüm standart laboratuvar ekipmanları ile gerçekleştirilebilir ve kolayca konak patojen etkileşimin diğer yönlerini incelemek için uyarlanabilir. Bu deneyler insan bağışçılarından alınan tam kanı kullanacak ve ilgili kurumsal komite nin veya inceleme kurulunun onayını ve tüm katılımcılardan bilgilendirilmiş onay alındığına dair bir beyan da gerekecektir. Bu işlemin ilk adımı, nötrofillerin santrifüj ve yoğunluk gradyanları ile izole edilmesidir.
İlk olarak, oda sıcaklığına %3 dekstran %0,9 sodyum klorür, %0,9 sodyum klorür 35 mililitre, %1,8 sodyum klorür 20 mililitre, mililitre ficoll çözeltisi başına 1,077 gram 12 mililitre ve 20 mililitre su getirin. 25 mililitre taze çekilmiş heparinize edilmiş tüm insan kanını iki konik santrifüj tüpüne aktarın. Oda sıcaklığında 25 mililitre eşdeğer hacim, 3% dextran, bire bir oranında% 0.9 sodyum klorür ile taze çizilmiş heparinized tam kan 25 mililitre birleştirin.
Her 50 mililitrelik konik tüpü hafifçe sallayarak karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika bekletin. Oda sıcaklığında kuluçkadan sonra iki ayrı katman görünür. Yeni 50 mililitre konik tüpler içine her dextran kan karışımı üst tabakası aktarın.
Düşük veya hiç mola vermeden oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 450 g santrifüj. Dikkatlice hem supernatants aspire ve hücre pelet rahatsız etmeden atın. Yavaşça% 0.9 sodyum klorür iki mililitre her hücre pelet askıya.
Tek bir resuspended pelet birleştirin, 50 mililitre konik sonra kalan 0.9% sodyum klorür 35 mililitre son hacmiekleyin. Dikkatle bir el pipet kullanarak hücre süspansiyon altında mililitre ficoll çözeltisi başına 1.077 gram 10 mililitre underlay. 450 g'de oda sıcaklığında 30 dakika döndükten sonra, düşük veya hiç mola vermeden, daha önce gösterildiği gibi hücre peletini rahatsız etmeden süpernatantı hafifçe aspire edin.
Oda sıcaklığında su 20 mililitre hücre pelet resuspend tarafından kırmızı kan hücreleri lyse. 30 saniye boyunca sallayarak hafifçe karıştırın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 450 g'da %1,8 sodyum klorür ve santrifüj numunesi ile 20 mililitre ekleyin.
Daha önce gösterildiği gibi dikkatle supernatant aspire. Yavaşça iki mililitre oda sıcaklığında RPMI hücre pelet askıya ve buz üzerinde yer. Hemacytometer kullanarak hücreleri say.
Saflaştırılmış PMN'leri, buz gibi RPMI ile mililitre başına 10 ila 7. 100 mikrolitre saflaştırılmış PMN'yi 300 mikrolitre DPBS ile birleştirin, iki çoğaltma akış sitometri tüpünde bir mikrolitre propidium iyodür lekesi içeren. Pozitif kontrol için, akış sitometri tüplerinden birine %0,5 Triton X-100 çözeltisi 40 mikrolitre ekleyin ve iyice karıştırın.
İzole PMN'lerin saflığını ve bütünlüğünü belirlemek için ileri saçılma, yan dağılım ve propidium iyodür boyamasını ölçmek için akış sitometrisini kullanın. Sadece %98 saf ve %95 propidium iyodür negatif üzerinde PMN preparatları kullanılmalıdır. Normal insan serumunun izolasyonuna dikkat eden protokol için, tam el yazmasına bakın.
Bu tahlilde kullanılacak bireysel kuyulara DPBS ile seyreltilmiş %20 izole edilmiş insan serumunun 100 mikrolitresini ekleyerek PMN sitotoksisite tahlilleri için 96 kuyuluk bir plaka hazırlayın. Sadece medya alacak en az bir negatif kontrol kuyusu ve 30 dakika boyunca 37 derece santigrat plaka% 0.05 Triton X.Incubate alacak en az bir pozitif kontrol kuyusu içerdiğinden emin olun. Kuluçkadan sonra, kodlanmış kuyuları 100 mikrolitre buz gibi DPBS ile iki kez yıkayın ve plakayı buza yerleştirin.
Plaka kuyularından kalan DPBS'yi çıkarın ve iyi kodlanmış her birine mililitre başına 10 defa 10'uncu saflaştırılmış insan PMN'si 100 mikrolitre ekleyin. Kaplama nötrofiller aşağıdaki sitotoksisite tahlilleri kullanmadan önce en az beş dakika buz üzerinde bırakarak yerleşmek için izin verin. Bu bölümde, stafilokok aureus tarafından üretilen ekstrasellüler proteinlerin sitotoksisitesini insan PMN'lerine karşı ölçen bir analiz açıklanmaktadır.
Kültür S.aureus bir gecede uygun ortamda bir sallayarak inkübatör kullanarak 37 santigrat derece önceki gün deneyin ayarlayın. Subculture S.aureus taze medya ile bir gecede bakteri kültürleri bir ila 100 seyreltme gerçekleştirerek. Bakteriler erken sabit büyüme aşamasına ulaşana kadar sallayarak 37 santigrat derecede kuluçka.
Büyüme beş saat sonra, oda sıcaklığında beş dakika için 5, 000 g bir 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp ve santrifüj içine altkültür S.aureus bir mililitre aktarın. Santrifüjden sonra, aspire süpernatantları. 0,22 mikron şırınga filtresiile yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüp ve buz üzerinde yer aspire supernatants geçirin.
Kültür Staph aureus için kullanılan buz gibi medya ile supernatants seri seyreltme gerçekleştirin. Daha önce açıklandığı gibi, buz üzerinde PMN'ler içeren 96 kuyuluk bir plakanın bireysel kuyularına negatif ve pozitif kontroller için ödünç verilen süpernatant numuneleri veya ortamları nazikçe ekleyin. Yavaşça kaya plaka sıyrıklarda supernatants dağıtmak ve 37 santigrat derece kuluçka.
İstenilen zamanlarda, kuvözden plakayı çıkarın ve buza yerleştirin. Her akış sitometri tüpüne bir mikrolitre propidium iyodür içeren 300 mikrolitre buz gibi DPBS ekleyin. Örnekleri buz üzerinde akan sitometri tüplerine aktarın.
Pozitif kontrol kuyusu için, bir akış sitometri tüpüne aktarmadan önce numuneye 20 mikrolitre %10 Triton X ekleyin. Akış sitometrisi kullanarak sarhoş PMN'lerin propidium iyodür boyama analiz edin. Bu bölümde, insan PMN'leri ile fagositöz sonrası S.aureus'un sitotoksisitesini ölçen bir analiz açıklanmaktadır.
600 nanometreoptik yoğunluğu ve bakteri konsantrasyonu tarafından tanımlanan büyüme eğrileri bu töz kullanmadan önce ilgili Staph aureus suşları için belirlenmelidir. Daha önce açıklandığı gibi, S.aureus suşları ve alt kültür bakterilerin in gece kültürleri başlayın. Bir kez altkültür Staph aureus orta üstel büyüme ulaştı, 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp ve santrifüj 5, 000 g oda sıcaklığında beş dakika için kültür bakterilerin bir mililitre transfer.
S.aureus'u peleti bozmadan süpernatantını azarlayarak yıkayın ve bir mililitre DPBS'de peletli bakterileri yeniden askıya alın. 30 saniye boyunca örnekleri girdap. Örnekleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 5,000 g'da santrifüj edin.
Staph aureus'u oksetmek için önce %20 insan serumunun bir mililitresinde bakteri peletini yeniden askıya alın. Sonra 37 derecede nisfora 15 dakika boyunca ajitasyon la örnekleri kuluçkaya yatırın. Daha önce gösterildiği gibi santrifüj aşağıdaki yıkama öküzlü Staph aureus.
Seyreltik öküzleşmiş Staph aureus suşları bir kez 10 için 8 koloni oluşturan birimleri, Mililitre başına CPU, buz gibi RPMI ile. 30 saniye boyunca örnek girdap ve buz üzerinde yerleştirin. Agar üzerinde bakterilerin 1 ila 10 seri seyreltme kaplama tarafından bu tahliller için kullanılan Staph aureus konsantrasyonlarını onaylayın.
1.14 adımdan itibaren buz üzerindeki 96 kuyuluk plakadaki PMN'lere her Staph aureus suşunun veya pozitif ve negatif kontroller için RPMI'nin kuyubaşına 100 mikrolitre ekleyin. Yavaşça kaya plaka kuyularda Staph aureus dağıtmak için. Fagositoz'u 500 g'da santrifüj plakaile dört santigrat derecede sekiz dakika, 37 santigrat derecede ise inkübasyon plakası ile senkronize edin.
İstenilen zaman noktalarında, plakayı buza koyun ve her akış sitometri tüpüne bir mikrolitre propidium iyodür içeren 200 mikrolitre buz gibi dpbs ekleyin ve numuneleri ilgili tüplerine aktarın. 2.8 ve 2.9'da açıklandığı gibi akış sitometrisi kullanarak propidium iyodür boyama örneklerini analiz edin. Staph aureus tarafından insan PMN'lerini hedef alan iki bileşenli lökotoksinlerin transkripsiyonu, insan PMN'lerine karşı Staph aureus sitotoksisitesini ölçmek için tanımlanan tahlillerin yararını göstermek için SA veya S2 bileşen sistemini gerektirir.
Bu deneyler, bu türdeki SA veya S'nin isolojenik deletion mutantında USA300 olarak tanımlanan klinik olarak alakalı Staph aureus izole edilmesi ile gerçekleştirilmiştir. Sol panel saflaştırılmış PMN'leri, sağ panel ise kasıtlı olarak kirlenmiş örnekleri örnek olarak gösterecektir. Bu protokolün birinci bölümünde açıklanan yordamlar kullanılarak izole edilen PMN'ler propidium iyodür ile boyanmış ve akış sitometrisi kullanılarak incelenmiştir.
1A ve 1B. PMN bütünlüğü propidium iyodür boyama kullanılarak belirlendi. İnsan PMN arınma açıklanan yöntemi ni kullanarak, biz sürekli üzerinde% 98 saf ve% 95 propidium iyodür negatif 8 PMNs için 7-bir kez 10 beş kez 10 izole edebilirsiniz.
USA300 ve AsaeR/S mutant tarafından üretilen ekstrasellüler proteinlerin sitotoksisitesi saflaştırılmış PMN'lere karşı test edildi. Bu deneyler, ABD300 tarafından üretilen ekstrasellüler proteinler ile 30 dakikalık zehirlenme sonrasında saflaştırılmış PMN'lerin propidium iyodür boyamasında konsantrasyona bağlı bir artış olduğunu göstermektedir, ancak AsaeR/S mutantı ile değil. Daha sonraki deneyler, yaklaşık 30 dakika sonra platolanan ABD300 hücre dışı proteinlerin zehirlenmesinden sonra propidium iyodür pozitif PMN'lerin oranında sürekli bir artış olduğunu göstermiştir.
AsaeR/S mutant ı tarafından üretilen ekstrasellüler proteinlere maruz kaldıktan sonra insan PMN'lerinin minimal propidium iyodür boyaması her zaman dikkat çekti. Son olarak, senkronize fagositoz sonrası PMN'lere karşı USA300 ve AsaeR/S mutantının sitotoksisitesi test edilmiş, USA300 fagositozundan 90 dakika sonra propidium iyodür pozitif PMN'lerin oranında konsantrasyona bağlı bir artış gözlenmiştir. AsaeR/S mutantının fagositozundan sonra önemli ölçüde daha az PMN propidium iyodür pozitifti.
Bu deneylerin her birinde ABD300 ve AsaeR/S mutant inoculum'un numaralandırması, bu suşlar arasındaki sitotoksisite kontrastının kullanılan bakterilerin konsantrasyonundaki farklılıklardan kaynaklanmadığını göstermiştir. Bu protokol, s.aureus'un sitotoksisitesini bu doğuştan gelen bağışıklık hücrelerine karşı ölçmek için iki farklı teknikle PMN'lerin insan kanından arınmalarını tanımlar. Bu prosedürlerin başarısı safpmns kalitesi ve Staph aureus bakteri veya supernatants uygun hazırlanmasına bağlı olacaktır.
Bu işlemleri gerçekleştirirken dikkat etmesi gereken önemli noktalar için lütfen yazının tamamına başvurun. USA300 öldürücü mrsa izole ve AsaeR / S kaybı önemli ölçüde insan PMNs hedef virülans faktörlerin transkripsiyon azaltır, bu suşları açıklanan tahliller kullanarak sitotoksisite karşılaştırmak için ideal modeller yapma. Staph aureus diğer suşları kullanırken büyüme koşulları, supernatants hacimleri veya PMN'ler için bakteri oranı terzilik gerekli olabilir.
