Lo Staphylococcus aureus è un batterio gram-positivo che produce una vasta gamma di fattori di virulenza che promuovono la patogenesi. Questi includono leucotossine bicomponenti che interrompono l'integrità della membrana dei leucociti polimorfonucleari, chiamati anche PMN o neutrofili. Questo video illustra l'isolamento delle PMN dal sangue intero umano e due test distinti per quantificare la citotossicità di S.aureus contro queste importanti cellule immunitarie innate.
Questi test possono essere tutti realizzati con attrezzature di laboratorio standard e sono facilmente adattabili per esaminare altri aspetti dell'interazione dell'agente patogeno ospite. Questi esperimenti utilizzeranno sangue intero prelevato da donatori umani e richiederanno l'approvazione del comitato istituzionale o del comitato di revisione competente, nonché una dichiarazione che ha ottenuto il consenso informato da tutti i partecipanti. Il primo passo di questa procedura è l'isolamento dei neutrofili attraverso l'uso di gradienti di centrifugazione e densità.
In primo luogo, portare 50 millilitri di cloruro di sodio 3%dextran 0,9%, 35 millilitri di cloruro di sodio allo 0,9%, 20 millilitri di cloruro di sodio all'1,8%, 12 millilitri di 1,077 grammi per soluzione di ficoll millilitro e 20 millilitri di acqua a temperatura ambiente. Trasferire 25 millilitri di sangue umano intero eparinizzato appena prelevato in due tubi di centrifuga conica. Unire 25 millilitri di sangue intero eparinizzato appena prelevato con 25 millilitri volume equivalente di temperatura ambiente, 3%dextran, 0,9% cloruro di sodio in un rapporto uno a uno.
Mescolare dondolando delicatamente ogni tubo conico da 50 millilitri e quindi lasciare riposare a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo l'incubazione a temperatura ambiente, appariranno due strati separati. Trasferire lo strato superiore di ogni miscela di sangue di dextran in nuovi tubi conici da 50 millilitri.
Centrifuga a 450 g per 10 minuti a temperatura ambiente con pause basse o nessuna. Aspirare con cura sia i supernatanti che scartare senza disturbare i pellet cellulari. Resostigliere delicatamente ogni pellet cellulare in due millilitri di cloruro di sodio dello 0,9%.
Unire i pellet rimorsi in un unico conico da 50 millilitri, quindi aggiungere il rimanente cloruro di sodio dello 0,9% a un volume finale di 35 millilitri. Sottotarsi con cura 10 millilitri di 1.077 grammi per soluzione di ficoll millilitro sotto la sospensione cellulare utilizzando una pipetta a mano. Dopo aver filato a 450 g per 30 minuti a temperatura ambiente, con pause basse o senza rotture, aspirare delicatamente il supernatante senza disturbare il pellet cellulare, come mostrato in precedenza.
Llyse i globuli rossi rimescolando il pellet cellulare in 20 millilitri di acqua a temperatura ambiente. Mescolare delicatamente dondolando per 30 secondi. Aggiungere immediatamente 20 millilitri di cloruro di sodio all'1,8% e campione di centrifuga a 450 g per 10 minuti a temperatura ambiente.
Aspirare con cura il supernatante come mostrato in precedenza. Riutilizzare delicatamente il pellet cellulare in RPMI a temperatura ambiente di due millilitri e posizionare sul ghiaccio. Contare le cellule usando un emacitometro.
Resuspend depurò le PMN purificate ad una concentrazione di una volta e 10 fino alle 7 ° cellule per millilitro con RPMI ghiacciato e tenere sul ghiaccio. Unire 100 microlitri di PMN purificati con 300 microlitri di DPBS, contenenti un microliter di macchie di ioduro di propidio in due tubi di citometria a flusso replicato. Per un controllo positivo, aggiungere 40 microlitri della soluzione 0,5%Triton X-100 in uno dei tubi di citometria di flusso e mescolare accuratamente.
Utilizzare la citometria del flusso per misurare la dispersione in avanti, la dispersione laterale e la colorazione dello ioduro di propidio per determinare la purezza e l'integrità delle PMN isolate. Devono essere utilizzati solo preparati PMN superiori al 98% puri e superiori al 95% propidio ioduro negativo. Per il protocollo che delinea l'isolamento del siero umano normale, fare riferimento al manoscritto completo.
Preparare una piastra da 96 per i test di citotossicità PMN aggiungendo 100 microlitri di siero umano isolato al 20% diluito con DPBS a singoli pozzi che verranno utilizzati in questo saggio. Assicurati di includere almeno un pozzo di controllo negativo che riceverà solo supporti e almeno un pozzo di controllo positivo che riceverà lo 0,05% di Triton X.Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo l'incubazione, lavare i pozzi codificati due volte con 100 microlitri di DPBS ghiacciato e posizionare la piastra sul ghiaccio.
Rimuovere eventuali DPBS residui dai pozzetti delle piastre e aggiungere delicatamente 100 microlitri di PMN umani purificati a una volta 10 alle 7 ° cellule per millilitro a ciascun pozzo codificato. Lasciare che i neutrofili placcati si sistemino lasciandoli sul ghiaccio per almeno cinque minuti prima dell'uso nei seguenti test di citotossicità. Questa sezione descrive un saggio che quantifica la citotossicità delle proteine extracellulari prodotte dallo staph aureus contro le PMN umane.
Culture S.aureus durante la notte su supporti appropriati utilizzando un incubatore di scuotimento impostato a 37 gradi Celsius il giorno prima dell'esperimento. Sottocultura S.aureus eseguendo una diluizione da uno a 100 di colture batteriche durante la notte con mezzi freschi. Incubare a 37 gradi Celsius con tremori fino a quando i batteri raggiungono la fase iniziale di crescita stazionaria.
Dopo cinque ore di crescita, trasferire un millilitro di sottocoltura S.aureus in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri e centrifugare a 5.000 g per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, aspirate i supernatanti. Passare i supernaganti aspirati attraverso un filtro siringa da 0,22 micron in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri e posizionarlo sul ghiaccio.
Eseguire diluizioni seriali di supernatanti con mezzi ghiacciati utilizzati per la coltura di Staph aureus. Aggiungere delicatamente campioni supernatanti o supporti prestati per controlli negativi e positivi ai singoli pozzi di una piastra da 96 pozzi contenente PMN sul ghiaccio, come descritto in precedenza. Dondola delicatamente per distribuire supernaganti in pozzi e incubare a 37 gradi Celsius.
Nei momenti desiderati, rimuovere la piastra dall'incubatore e posizionarsi sul ghiaccio. Aggiungere 300 microlitri di DPBS ghiacciato contenenti un microlitro di ioduro di propidio ad ogni tubo di citometria a flusso. Trasferire i campioni in tubi di citometria a flusso sul ghiaccio.
Per il pozzo di controllo positivo, aggiungere 20 microlitri del 10%Triton X al campione prima del trasferimento in un tubo di citometria a flusso. Analizzare la colorazione dello ioduro propidio delle PMN intossicate utilizzando la citometria del flusso. Questa sezione descrive un saggio che quantifica la citotossicità di S.aureus a seguito della fagocitosi da parte delle PMN umane.
Le curve di crescita definite dalla densità ottica a 600 nanometri e dalla concentrazione di batteri devono essere determinate per i ceppi di Staph aureus pertinenti prima dell'uso in questo saggio. Inizia colture notturne di ceppi di S.aureus e batteri della sottocultura, come descritto in precedenza. Una volta che lo Staph aureus sottocolto ha raggiunto una crescita medio-esponenziale, trasferire un millilitro di batteri di coltura in tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri e centrifugare a 5.000 g per cinque minuti a temperatura ambiente.
Lavare S.aureus aspirando il suo supernatante senza disturbare il pellet e rimescolare i batteri pelletturi in un millilitro DPBS. Vortice i campioni per 30 secondi. Centrifugare i campioni a 5.000 g per cinque minuti a temperatura ambiente.
Per buoizzare Staph aureus, resospendare prima il pellet batterico in un millilitro di siero umano al 20%. Quindi incubare i campioni a 37 gradi Celsius con agitazione per 15 minuti. Lavare lo Staph aureus buoizzato dopo la centrifugazione come mostrato in precedenza.
Diluire i ceppi di Staph aureus buoi fino a uno per 10 fino all'8a unità di formazione della colonia, CNO per millilitro, con RPMI ghiacciato. Vortice il campione per 30 secondi e posizionare sul ghiaccio. Confermare le concentrazioni di Staph aureus utilizzate per questi saggi placcando da una a 10 diluizioni seriali di batteri sull'agar.
Aggiungere delicatamente 100 microlitri per pozzo di ogni ceppo di stafilococco, o RPMI per controlli positivi e negativi, alle PMN in una piastra da 96 porri sul ghiaccio dal passo 1.14. Piastra di roccia delicata per distribuire Staph aureus in pozzi. Sincronizzare la fagocitosi centrifugando la piastra a 500 g per otto minuti a quattro gradi Celsius e incubare la piastra a 37 gradi Celsius immediatamente dopo la centrifugazione come tempo zero.
Nei punti di tempo desiderati, mettere la piastra sul ghiaccio e aggiungere 200 microlitri di DPBS ghiacciato contenenti uno ioduro di propidio microlitri a ciascun tubo citometrico di flusso, quindi trasferire campioni al tubo corrispondente. Analizzare i campioni per la colorazione dello ioduro di propidio utilizzando la citometria del flusso come descritto nei precedenti 2.8 e 2.9. La trascrizione delle leucotossine bicomponenti che prendono di mira le PMN umane da parte di Staph aureus richiede che il sistema componente SA o S2 dimostri l'utilità dei test descritti per quantificare la citotossicità di Staph aureus contro le PMN umane.
Questi esperimenti sono stati eseguiti con un isolato di Staph aureus clinicamente rilevante identificato come USA300 in un mutante di cancellazione isologenica di SA o S in questo ceppo. Il pannello sinistro raffigura LEN purificate e il pannello destro descrive campioni intenzionalmente contaminati come esempio. Le PMN isolate utilizzando le procedure descritte nella sezione uno di questo protocollo sono state macchiate di ioduro di propidio ed esaminate utilizzando la citometria del flusso.
I grafici a dispersione anteriore e laterale sono stati utilizzati per rilevare la contaminazione delle PMN purificate da monociti o linfociti per anni 1A e 1B. Utilizzando il metodo descritto di purificazione DELLA PMN umana, possiamo isolare costantemente cinque volte 10 fino al 7°-uno per 10 fino all'8 ° PMN che sono oltre il 98% puri e sono oltre il 95% propidio ioduro negativo.
La citotossicità delle proteine extracellulari prodotte da USA300 e dal mutante AsaeR/S è stata testata contro le PMN purificate. Questi esperimenti dimostrano un aumento dipendente dalla concentrazione nella colorazione dello ioduro propidio delle PMN purificate dopo 30 minuti di intossicazione con proteine extracellulari prodotte da USA300, ma non con il mutante AsaeR/S. Ulteriori esperimenti hanno dimostrato un costante aumento della proporzione di PMN positive propididio ioduro a seguito dell'intossicazione da parte delle proteine extracellulari USA300 che si è stabilizzata dopo circa 30 minuti.
La colorazione minima dello ioduro propidio delle NN umane è stata notata in tutti i punti di tempo in seguito all'esposizione a proteine extracellulari prodotte dal mutante AsaeR/S. Infine, è stata testata la citotossicità del mutante USA300 e AsaeR/S nei confronti delle PMN a seguito della fagocitosi sincronizzata, è stato osservato un aumento dipendente dalla concentrazione della proporzione di PMN positive allo ioduro propidio 90 minuti dopo la fagocitosi di USA300. Significativamente meno PMN erano propidi ioduro positivo a seguito della fagocitosi del mutante AsaeR/S.
L'enumerazione dell'inoculo mutante USA300 e AsaeR/S è stata utilizzata in ciascuno di questi esperimenti ha dimostrato che il contrasto nella citotossicità tra questi ceppi non era dovuto alle differenze nella concentrazione di batteri utilizzati. Questo protocollo descrive le purificazioni delle PMN dal sangue umano in due tecniche distinte per quantificare la citotossicità di S.aureus contro queste cellule immunitarie innate. Il successo di queste procedure dipenderà dalla qualità delle PMN purificate e dall'adeguata preparazione di batteri o supernatanti Staph aureus.
Si prega di consultare il manoscritto completo per i punti importanti da considerare durante l'esecuzione di queste procedure. USA300 è un isolato MRSA virulento e la perdita di AsaeR/S riduce drasticamente la trascrizione dei fattori di virulenza che prendono di mira le PMN umane, rendendo questi ceppi modelli ideali per confrontare la citotossicità usando i test descritti. Quando si utilizzano altri ceppi di Staph aureus, possono essere necessari adattare le condizioni di crescita, i volumi di supernatanti aggiunti o il rapporto tra batteri e PMN.
