Bu yöntem aynı zamanda membran bütünlüğü ve hücre altı mimarisi ni koruyarak bir membran proteiniçin leke yeteneği birleştirir. Yani bir zarla ilişkili proteini tam olarak lokalize etmek için gerçekten güçlüdür. Bu tekniğin en büyük avantajı, cryofixation ve freeze ikamesi de dahil olmak üzere elektron mikroskobu için hücresel koruma da son teknoloji yöntemleri ile sağlam bir genetik klonlanabilir etiket, APEX2 kullanımı birleştirir.
Birlikte, bu iyi korunmuş bir hücre içinde hassas protein lokalizasyonu sağlar. Bu protokol, virüslerin ana hücre içinde çoğaldığı mekanizmaları incelemek için kullanılabilir. Virüsler genellikle kendi enfeksiyon düzeni sırasında konak proteinleri kaçırmak olacaktır.
Virüsler, bu konak hücrelerin içinde çoğalmak için kullandıkları küçük genomlardır. Son zamanlarda, yayınlanmamış verilerle bu proteinleri virüslerin nasıl çoğaldığını anlamak için bu teknolojiyi kullanarak etiketleyebildik. Bu teknik golgi arıza neden olan bir bakteriyel toksin üzerinde son ortak çalışmada gerçekten kritik olduğunu kanıtladı.
CryoAPEX kullanarak, biz tam parçalanmış golgi parçaları ile toksin lokalize başardık, aksi takdirde normal immünororesans teknikleri kullanarak görmek gerçekten zor bir şey. Bu tekniği gösteren Elaine Mihelc, bir lisansüstü öğrenci ve araştırma görevlisi, Stephanie Angel, bizim laboratuvarlardan olacaktır. Çanak hek293 hücreleri tohumlama sonra, APEX2 ile hücreleri transfect üreticinin talimatlarına göre transfeksiyon reaktif kullanarak memeli ekspresyonu plazmidler etiketli.
Transfeksiyon sonrası 12-15 saat, pbs ile bir kez hücreleri yıkayın. Daha sonra, 15 mililitrelik konik tüp içine çanak PBS ile hücreleri yıkayın. 5dakika 500 x g'de santrifüj.
Dikkatle supernatant çıkarın ve oda sıcaklığında pH 7.4 de% 2 glutaraldehit ve 0.1 molar sodyum cacodylate tampon iki mililitre pelet yeniden askıya. 30 dakika kuluçka için buz üzerinde örnek yerleştirin. Daha sonra, 4 santigrat derece beş dakika için 500 x g örnek pelet.
Peleti her biri 0,1 molar sodyum kacodylate tamponunun iki mililitresi ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Santrifüjden sonra, supernatant çıkarın. Peroksidaz reaksiyonu gerçekleştirmek için, 500 x g'de 500 x g'da beş dakika peletleme nin ardından üç mililitre DAB çözeltisi içinde yeniden askıya alarak peleti yıkayın.
Sonra, 5.88 milimoler hidrojen peroksit ile DAB çözeltisi üç mililitre pelet yeniden askıya. Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yat. Pelet görünür kahverengi renkli olur, çözünmez DAB reaksiyon ürün varlığını gösteren.
El yazmasına göre, DMEM'de sodyum kacodylate tamponu ile tekrar yıkandıktan sonra, %10 fetal sığır serumu ve %15 büyükbaş serum albumin içeren DMEM'in kriyoprotektif çözeltisinin 500 mikrolitresinde hücre peletini yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonuna 0.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpü aktarın. Pelet tekrar, biraz 500 x g santrifüj hızını artırarak.
Peletin kuruması için yeterli sıvının kalmasını sağlayarak supernatantın çoğunluğunu atın. Wick uzak bir laboratuvar silme veya kağıt havlu köşesini kullanarak hücre pelet kalan sıvı. Yeterince sıvı pelet diş macunu tutarlılık benzer bir hamur oluşturur kalsın.
Hücre peletinin 2-3 mikrolitresini aspire edin ve bir membran taşıyıcısına yatırın. Membran taşıyıcısının kuyuyu tamamen doldurun, böylece yüzey gerilimi üstte hafif bir kubbe oluşturur. Membran taşıyıcısını kartuşa doğru kaydırın ve emniyete alanın.
Kartuşun hazırlanmış ve astarlanmış HPF makinesine yerleştirin ve donmaya başlayın. Kartuşları sıvı nitrojene batırılmış olarak tutarak, membran taşıyıcısını kartuşundan çıkarın. Plastik bir kapsül içine yerleştirin ve sıvı nitrojen dolu bir Cryovial içine plastik kapsül yerleştirin.
Kimyasal bir başlık, hacim tannik asit ve bir Cryovial aseton% 5 DI su ile% 0.2 ağırlık çözeltisi başına bir mililitre hazırlamak. Dondurmak için sıvı nitrojen içine yerleştirin. Donma ikame karışımı bir şişe ve dondurulmuş hücre pelet içeren Cryovials dondurma ikame birimleri örnek odasına yerleştirin.
Membran taşıyıcısını içeren iç kapsülü sıvı azot şişesinden ilgili şişeiçeren donma ikame karışımına aktarın. 90 santigrat derecede bir dondurma değiştirme protokolü başlatın. 24 saat sonra, dondurma ikamesini duraklatın ve numuneleri 90 santigrat dereceye kadar soğutulmuş aseton ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın.
Daha sonra, kimyasal bir başlık, bir Cryovial aseton% 1 osmiyum tetroksit, 0.2% uranyl asetat ve% 5 DI su bir çözelti nin numune başına bir mililitre hazırlamak ve dondurmak için sıvı nitrojen yerleştirin. Freeze ikame birimi içine iki karışımı ile Cryovials yerleştirin ve dondurma ikame karışımı içine üçüncü aseton yıkama kapsül leri aktarın iki şişe. Onları kuluçkave dondurma ikame karışımı 90 santigrat derece 72 saat için iki, 12-18 saat içinde sıfır derece santigrat kademeli ısınma izledi.
Sıcaklığı sıfır derecede tutun ve şişelere önceden soğutulmuş aseton ekleyerek her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Üreticinin talimatlarına göre plastik bir kabın tercih edilen bir reçin karışımı hazırlayın ve kapsülbatık için şişeler içine% 2 4 ve% 8 reçin ekleyin. Her biri sıfır derecede iki saat kuluçkaya yat.
Daha sonra, oda sıcaklığında her biri dört saat boyunca %15%30%60%90 ve A, B ve D'nin %100 reçine bileşenlerinde kuluçkaya yatırın. 20 saat sonra, rekarn bileşenleri A, B, C ve D karışımı nı hazırlayın ve dört saat kuluçkaya yatırın. Hücre pelet tarafı ile membran taşıyıcıları düz gömme kalıplara yerleştirin ve 24-36 saat boyunca 60 derecede polimerize etmek için bir fırına reşin karışımı A, B, C ve D.Place onları doldurun.
Polimerizasyondan sonra, kalıptaki blokları çıkarın ve numuneyi büyütme ile görselleştirilebilen ultra mikrotomun dikey aynasına yerleştirin. Membran taşıyıcısını, metali plastikten ayırmak için membran taşıyıcısında sıvı nitrojen inip bir kombinasyon oluşturarak ve membran taşıyıcısının etrafındaki resenin yongasını parçalamak için bir jilet kullanarak bloktan ayırın. Ayrıldığınızda, yavaşça blok yüzünde hücre pelet kubbe bırakarak, membran taşıyıcı kaldırın.
İlk kalıptan biraz daha derin olan düz bir katıştırma kalıbına bakacak şekilde bloğu açıkta kalan hücre peletini yerleştirin ve 24-36 saat boyunca 60 derecede A, B, C ve D.Polimerize rezorabileşenleriyle doldurun. Bir jilet kullanarak hücre pelet etrafında blok kırpın. Daha sonra ultra mikrotomun kesit koluna blok uyerleştirin.
Bir cam veya elmas bıçak kullanarak, hücre pelet çevreleyen bir yamuk şeklinde blok kırpın. Bir cam veya elmas bıçak kullanarak hücre pelet 90 nanometre ultra ince bölümleri elde edin. TEM şebekesindeki bölümlerden oluşan bir şerit seçin.
Kenarı bir filtre kağıdı üzerinde lekeleyerek ızgarayı kurutun ve TEM ızgara depolama kutusunda saklayın. Izgarayı TEM tutucuya monte edin ve tutucuyu mikroskoba yerleştirin. CryoAPEX numunelerinin taranması için 80 kilovolt'ta Tecnai T12 kullanın.
APEX2 etiketleme ile hücrelerin ve hücre altı yapıların görüntülerini edinin. Bu çalışmada, numunenin geleneksel APEX yöntemleri ile hazırlanması organize, pürüzsüz endoplazmik retikulum yapılarının açık bir şekilde etiketletilmesi ile sonuçlanmıştır. Yüksek büyütme de, yığılmış membranlar kabarık ve konsantrik membran yoğunlukları arasında tekdüze olmayan boşluklar mevcut olarak ortaya çıktı, kötü membran koruma ve lipid çıkarma gösteren.
CryoAPEX tarafından hazırlanan örnek de organize, pürüzsüz endoplazmik retikulum yapıların açıkça tanımlanmış etiketleme vardı, ancak, membranlar pürüzsüz ve paralel ve çok az lipid ekstraksiyon görüldü. 90 nanometre inceliğinde yapılan TEM analizi, Huntington mayası etkileşen protein E'nin periferik endoplazmik retikulum ve nükleer zarf boyunca mevcut olduğunu ortaya koymuştur. Ayrıca, Huntington maya etkileşimprotein E yoğunluğu luminal endoplazmik retikulum membran boyunca düzenli aralıklı foci içine çözüldü.
Huntington mayası etkileşen protein E dağılımı ve foci de geleneksel fiksasyon ve dehidratasyon ile hazırlanan bir örnekte görülebilir. Ancak, geniş membran bozulması ve ekstraksiyon, örnek suboptimal hale mevcuttu. APEX2 etiketleme sito-V5-APEX2 sadece mitokondri ye özgü boyama sağlayan ve CAAX-APEX2'nin sadece plazma zarında belirgin boyama ürettiği üç hücresel belirteç kullanılarak yapıldı.
Hücre içi organellerde etiketleme gözlenmedi. Golgi lümeniçin boyama da orijinal Sengupta ve ark el yazması açıklandığı gibi bir Alpha MAN2-APEX2 marker kullanılarak değerlendirildi. Bu işlemden sonra, bir proteinin 3Boyutlu dağılımını araştırmak için elektron tomografisi veya odaklanmış iyon ışını taramalı elektron mikroskobu gibi üç boyutlu yöntemler uygulanabilir.
Bu protokolde kullanılan kimyasalların çoğu toksiktir, bu nedenle kullanılmadan önce, kimyasalların uygun kişisel koruyucu ekipmanlar kullanılarak işlendiğinden ve kurumsal kurallara uygun olarak bertaraf edilmesini sağlamak için güvenlik veri levhalarına danışılmalıdır.
