Reseptör kümeleme her yerde ve genellikle bir basamaklı aktivasyon sinyal için gereklidir. Ancak, kümeleme derecesini ölçmek için birkaç yöntem kullanılabilir. Canlı hücrelerin plazma zarındaki FGFR1-mEGFP moleküllerinin difüzyonunu takip etmek için total internal resmefleks, TIRF mikroskopisi kullanıyoruz.
Daha sonra uyarılmış reseptör kümeleme dinamiklerini tanımlamak için sayı parlaklığı, N & B analizi uygulayın. TIRF hücre yüzeyine yakın meydana moleküler olayların hızlı zamansal görüntüleme için idealdir, N & B mikroskop aydınlatma hacmi içinde ve dışında difüzyon nerede dayalı floresan moleküllerin ortalama oligomerik durumunu belirler. Gerçekten de, bu sinyal hücre yüzeyinde ki reseptörlerin mekansal zamansal organizasyon bağlamak için bir araçtır.
N&B'nin sadece hızlı satın alma modülüne sahip bir mikroskoba erişmesi gerekir. Floresan dalgalanma yöntemleri sadece temel bilgiye sahip canlı hücrelerin geniş alan analiz edebilirsiniz. Bu yöntem dimers veya kümeler oluşturan proteinlere uygulanabilir ve floresan boya ile stokiyometrik olarak etiketlenebilir.
Proteinler hücre içi bölmelerde ise, görüntüleri elde etmek için diğer mikroskop türleri kullanılır. Floroforun monomerik formunu deneysel koşullar altında ölçmek için ifade eden bir yapı hazırlamak önemlidir. İlk gün, cam dipli yemeklerde mililitre başına 100, 000 ila 200, 000 hücre konsantrasyonu ile tam orta 1,5 mililitre tohum HeLa hücreleri.
Tohum 6-8 tabak çoğaltmak, ve 37 santigrat derece bir kuluçka. İkinci veya üçüncü günde, hücreler alt bir araya gelmiştir. Yemeklerin yarısına protein plazmidi içeren serumsuz orta madde ekleyin ve hücreleri transfekte etmek için yemeklerin ikinci yarısına monomer ve dimer ile referans plazmidler ekleyin.
Bir gün sonra, transfected hücrelerin bulaşıkların altına yapışıp yapışmadığını ve hücre zarının floresan olup olmadığını kontrol edin. Aşırı büyümüş hücreler le veya çok düşük floresan ile bulaşıkları atın. Deneyden dört saat önce, mikroskobun sıcaklık kuluçka makinesini 37 santigrat derecede çalıştırın.
Mikroskobu, bilgisayarları ve kameraları açın ve kameraların eksi 75 santigrat dereceye ulaşmasını bekleyin. Objektif lens üzerine yağ küçük bir damla yerleştirin. Mikroskobun kuvöze örnek bir çanak koyun ve kabın sıcaklığının 10 dakika boyunca dengelemesini sağlamak için kuvöz kapılarını kapatın.
Epifloresan lambasını ve 488 nanometre lazeri açın. Örneği keşfetmek için epifloresan kontrast modunu seçin ve göz merceğinden odaklanmak için bir hücreyi arayarak. Bandpass Ex 490/20 500 ve bandpass Em 525/50 veya benzeri bantlı mikroskop kamera ile yeşil emisyon toplamak için uygun filtreseçin.
Epifloresan modunda göz örüntüden kam raporuna geçin. Odağı hassaslaştırın ve TIRF moduna geçin. Sonra TIRF mikroskobun talimatları aşağıdaki otomatik hizalama etkinleştirin.
Uygun bir aydınlatma derinliği seçin ve evanescent alanın yönünü optimize edin. İkinci kameraya geç. En az 256'ya 256 piksel ilgi çekici bir bölge tanımlayın.
Pozlamayı bir milisaniyeye ve EM kazancını 1.000'e ayarlayın. Lazer gücünü 0,5 miliwatt'a ayarlayın. Pozverme süresi, floresan moleküllerin ışıklı hacimde harcadığı ortalama süreden daha kısa olması gerektiğinden, proteinin difüzyon katsayısı hakkında bilgi sahibi olmak gerekir.
İlk koşullar altında ilk deneme sırasını çalıştırın ve sinyal-gürültü değerini kabaca tahmin edin. Koşullar, ilk kez yapılan seride ölçüldüğü gibi, sinyal-gürültüye 2-3 veya daha yüksek düzeyde kabul edilebilir. Ardından, görüntünün bir tarafını maskelemek için iki numaralı kamerayı mikroskoba bağlayan emisyon bölme sisteminin kaydırıcısını kullanın.
Kamera dosyası otomatik kaydetme seçeneğini seçin. En az 700 kare lik en az iki sinyal-gürültü oranıyla görüntü serisinin satın alınmasını başlatın. Mikroskop dışında çanak almadan, ligand ekleyin.
Parlak floresan membranı olan bir hücre seçin ve kinetik çalıştırmanın ilk serisini hızla başlatın. İkinci bir hücrede arama yapın ve kinetik ikinci kez nokta elde. Kinetik çalıştırmanın her zaman noktası için yeni bir hücre yakalayın.
Her yeni yemek için lazer hattının hizalanmasını ve TIRF aydınlatmasının optimizasyonunu tekrarlayın. Şimdi dönüştürmek ve tif dosyaları olarak kamera yazılımı ile edinilen görüntü dosyaları kaydedin. N&B grafik kullanıcısı interfaz MATLAB'ı etkinleştirerek analiz yazılımı yordamındaki tif dosyalarını içe aktarın.
Ortalama yoğunluk profilinin %10'dan fazla fotobeyaztma ve satın alma sırasında belirgin bir hücre zarı bozulması veya çevirisi olduğu serileri atın. Belirgin bir şekilde odak dışında olan kırpma çerçeveleri. Analiz için en az 500 zaman dilimi olan sadece serileri saklayın.
Önce kamera parametrelerini belirleyin. Rutin kalibre kamerayı etkinleştirin. Dedektör gürültü bölgesinde en az 20 ile 50 piksellik bir alan seçin.
Günlük sıklığı ve dijital düzey çiziminde, eğrinin doğrusal kısmında Gaussian'ı sınırlamak için doğrusal kırmızı imleci hareket ettirin. B tuşunu etkinleştirin. Verilerin dağılımını azaltmak ve B-I histogramını oluşturmak için en az 2,2 binning uygulayın.
B-I histogramını incelemek için yinelemeli kare imleci kullanın. Çözümleme için bir kare yg seçin ve seçili YG'nin B-haritasını oluşturun. Ardından, seçimle ilişkili B değerlerinin ASCII dosyasını kaydedin.
Verilerin frekans dağılımını hesaplamak ve kinetik çalıştırmanın her zaman noktasında her hücre için ortalama parlaklığı elde etmek için epsilon denklemini uygulamak için bir grafik yazılımında ASCII'yi içe aktarın ve ortalama B değeri artı veya eksi S.E.Apply'u edinin. Verileri normalleştirme denklemine göre normalleştirin, B't ligand ilavesi sonrasında t'de ölçülen ortalama B değeri, B'0 ise t'nin sıfıra eşit olduğu anda ölçülen ortalama B değeridir, bu da ligand additino'dan 10 ila 20 saniye sonradır. Kinetik çalıştırmayı oluşturmak için normalleştirilmiş ortalama parlaklığa karşı edinme süresini çizin.
Bu çalışmada, fgf2 mililitre başına 20 nanogram eklenmesinden sonra, sıfır ve yedi zamanda yakalanan mEGFP-FGR1 ifade aynı çanak iki HeLa hücrelerinin temsil sonuçları, burada gösterilmiştir. Referans yapıları, GPI-mEGFP ve GPI-mEGFP-mEGFP dimer ile karşılaştırıldığında, tüm analiz dizisi zaman serisinin ortalama yoğunluğunu gösterir. Tüm B değerlerinin çizimi.
B-I histogramı. Seçilen YG'nin B-haritası. Ve ilişkili B-dağılım histogramı.
FGF2 mililitre başına 20 nanogram ile stimülasyon sonra, temsili kinetik zaman fonksiyonu olarak ortalama parlaklığı gösteren çalışır hücre yüzeyinde birkaç dakika devam dimerization yavaş süreci açıklar. NCAM-Fc mililitre başına 50 mikrogram ile uyarıldığında, kinetik profil oligomerik karışımlarda reseptörün hızlı ve döngüsel geçişleri ortaya koymaktadır, aynı zamanda dimer üzerinde parlaklık değerlerine ulaşır. Normalleştirilmiş ortalama değeri üç tekrar tekrar gözlenir.
Hiçbir moleküler dalgalanmalar ve beyazlatma nedeniyle ekstra varyantları en aza indirmek için önemlidir. Ve hücreler cam dipli çanağa iyi yapışmış olmalı, aşırı büyümüş değil, ve yığılmış değil. Hücre içi bölmelerde daha hızlı yayılan bir proteinle ilgileniyorsak, daha hızlı sıfır kat uygulayabilir ve hücre içindeki görüntüyü odak veya multifoton mikroskoplarda tarayabilir.
Yaklaşımımızla, karartma gibi olayların dinamiklerini keşfetmek istediğimizde fotobeyaztmanın zararlı etkilerini en aza indiririz. Bu olaylar hücresel yanıtları çeşitli kontrol ve diğer teknikler ile canlı hücrelerde kanıtlamak çok zordur.
