SUMO bağlayıcı varlıklar in vivo endojen SUMOylated proteinleri izole etmek mümkün kılar. Bu oldukça aktif SUMO özgü proteaz varlığı ve in vivo SUMOylated proteinlerin düşük fraksiyonları nedeniyle zordur. SUMOylated proteomun SUMO bağlayıcı varlıklar kullanılarak izolasyonu, SUMO yüzeyleri için genel yakınlıktaki artışı erteleyerek avantajlıdır.
Bunun nedeni, SUBEs'in, SIM'lerin tandem tekrarlarını oluşturan proteinlerde yaygın olması ve böylece modifiye proteinler üzerinde özellikle SUMO moleküllerini tanımasıdır. Karaciğer kanserinde SUMOylated proteom izolasyon ve karakterizasyonu için SUMO bağlayıcı varlıkların kullanımı hızlı ve hassas bir yöntemdir. Bu potansiyel bir terapötik yaklaşım karaciğer kanserinde SUMOylation yolunun oldukça bilinmeyen rolü hakkında geçmiş bilgiler sağlar.
SUMO-bağlayıcı varlıklar izole etmek ve karaciğer dışında diğer dokularda SUMOylated proteom karakterize etmek için kullanılabilir, hem insan örnekleri ve hayvan modelleri, hem de çeşitli hücresel modellerde. Bu tekniğin gerçeklemesi kolay olsa da, aynı türde birden fazla örnek analiz edilirken dikkatli olunmalıdır. ilgili birkaç adımsoğutucu küp.
Bu nedenle, bu denemeyi başlatmadan önce tüplerin dikkatlice tesviye sini öneririz. SUMO bağlayıcı varlıkların kullanımının görsel gösterimi, özellikle bitlerin işlenmesindeki güçlükler ve protokol sırasında malzeme kaybı nedeniyle bu protokolün devrimini kolaylaştırmaktadır. İnsan hepatoma hücreleri daha önce p100 plakalı kaplama hücreleri tarafından çanak başına 1,2 ila 1,5 milyon hücre yoğunluğunda hazırlanmıştır ve bunları 37 santigrat derecede standart büyüme medyasında muhafaza eder.
Hücreleri kullanmaya hazır olduğunuzda, plakalardan ortam aspire ve steril PBS beş milimetre ile yıkayın. Plakayı buza koyun ve el yazması talimatlara göre 500 mikrolitre likis tamponu ekleyin. Daha sonra bir hücre kazıyıcı kullanarak plakanın altındaki hücreleri yavaşça lysis ortamına kazıyın.
Alternatif olarak, tripsinizasyon ile hücreleri hasat ve hücrelerin kaplı olduğundan emin olmak için plaka tripsin-EDTA bir mililitre ekleyin. Plakayı 5 dakika boyunca 37 derece lik bir kuluçka makinesine koyun ve böylece plakadan ayrılmasını bekleyin, sonra trippsinizasyonu durdurmak için iki mililitre önceden ısıtılmış büyüme ortamı ekleyin. Hücreleri 150 kez G'de 10 dakika santrifüj edin ve süpernatantı aspire edin.
Daha sonra hücreleri PBS ve santrifüj ile 10 dakika daha yıkayın. Supernatant aspirate ve lysis tampon 500 mikrolitre ekleyin. Lyse hücrelerini 15000 kez G ve 4 santigrat derece 10 dakika santrifüj edin, sonra süpernatantları yeni bir tüpe aktarın ve peleti atın.
Hasat edilen fare karaciğerlerini kullanmaya hazır olduğunuzda, bir mililitre buz gibi lysis tamponunda 75 miligram taze veya kopmuş donmuş parçayı homojenize edin. Homogenizer'ı el yazması talimatlara göre çalıştırın. Doku homojenizasyonundan sonra, numuneleri 15000 kez G ve dört santigrat derece 10 dakika santrifüj edin.
Supernatant'ı yeni bir tüpe aktarın ve peleti atın. 70 miligram boncuklara bir mililitre iyonize su ekleyerek ve dört degress Santigrat'ta bir gecede yeniden yerleştirerek glutatyon boncukları hazırlayın. Şişkinlik ten sonra, boncukları 10 mililitre de-iyonize su veya PBS ile üç kez yıkayın, her yıkamadan sonra 5 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj edin.
Yıkamadan sonra, 100 mikrogram GST-SUBEs veya GST kontrolünde 100 mikrogram glutatyon boncuk bulamacı ve 500 mikrolitre PBS için her örnek için %50 bulamaç elde etmek için boncukları pbs'nin bir mililitresinde yeniden askıya alın. Karışımı dönerken en az iki saat boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın, ardından boncukları 300 kez G'de beş dakika santrifüj le geri alın ve PBS'de yeniden askıya alın. Önceden hazırlanmış hücre lysate% 10 alın ve 3X kaynama tampon eşit hacimde seyreltin.
Glutatyon boncuk bulamacının 100 mikrolitresine 450 mikrolitre açıklık lısat ekleyin. Lysate'yi boncuklarla birlikte en az iki saat boyunca dört derece yedirin ve yavaşça döner. Kuluçkadan sonra, boncukları 5 dakika boyunca 300 kez G'ye çevirin ve analiz için süpernatantı toplayın.
Toplam hacmin %10'u ayrı bir tüpe aktarın ve eşit hacimde 3X kaynama tamponu ekleyin. Kalan numuneyi %05 Ara 20 ile bir mililitre buz gibi PBS ekleyerek ve bir dakika boyunca 300 kez G ve dört santigrat derecede aşağı doğru döndürerek üç kez yıkayın. Sıvı kalmadığından emin olmak için süpernatantı dikkatlice aspire edin.
Daha sonra 15 mikrolitre 3X kaynama tamponu ve 15 mikrolitre lysis tampon uçözün. El yazması yönlere göre batı leke analizi yapın. Kütle-Spektrometresi yapıyorsanız, aşama ucu C18 mikrokolonları kullanarak peptidleri tuzdan arındırın ve analiz den önce %0,1 formik asitle yeniden askıya alın.
Örnekleri bir LC-MS sistemine yükleyin ve üç aylık kenetleyin. Ilişkili yazılımı kullanarak protein tanımlama ve bolluk hesaplaması ile devam edin. El yazması yönlere göre istatistiksel analiz yapın.
Bu protokol, karaciğer kanseri ve yabani tip çöplerin spontan gelişimine neden olan glisin N-metiltransferaz eksikliği olan farelerde SUMOylated proteinleri izole etmek için kullanılmıştır. Ponceau S boyama giriş, akış-through ve SUBEs pull-down tsay BOUND Kesirler yapıldı. SUBEs ile yakalanan LKB1 Batı blot analizi karaciğer tümörlerinde LKB1 SUMOylation düzeyleri artar olduğunu göstermektedir.
Sumo-trap'in doğal SUMOylated proteinlerle etkileşime girme kapasitesini araştırmak için insan hepatoma hücreleri ve dönüşümsüz karaciğer epitel hücreleri kullanıldı. İlk olarak, konvansiyonel protein boyama SUBEs ile yakalanan toplam malzeme görselleştirmek için kullanılmıştır. Daha sonra Kütle-Spektrometresi, hepatoma hücreLI SUBEs örneğinde 742 proteinin, 577 proteinin ise karaciğer epitel olmayan dönüştürülmüş hücre SUBEs örneğinde zenginleştirilmiş olduğunu gösterdi.
SUBEs ile deneyler yaparken, bubuz üzerinde hücreleri ve dokuları korumak ve SUMOylated saflığını korumak için lysis tampon belirli mililitre eklemek önemlidir. SUMOylated proteomu SUBEs ile görselleştirdikten sonra, ya batı leke analizi veya Kütle-Spektrometresi kullanarak karakterizasyonu bulabilirsiniz. Karaciğer kanseri dokuları ve hepatoma hücrelerinde SUMOylated proteomu izole etmek ve karakterize etmek için SUBEs uygulaması potansiyel bir terapötik mekanizma sağlayabilir karaciğer kanserinde SUMO post-çeviri değişikliklerin rolünü keşfetmek için yol açıyor.
