SUMO 结合实体 （SUBEs） 作为肝癌中 SUMO 蛋白酶的浓缩、分离、识别和表征的工具

SUMO 结合实体使得在体内分离内源性 SUMOylat 蛋白成为可能。这是相当具有挑战性的，因为存在活性相扑特异性蛋白酶和体内SUMOylated蛋白的低分数。使用 SUMO 绑定实体隔离 SUMOylated 蛋白质组是有利的，因为它推迟了 SUMO 基质整体亲和力的增加。

这是因为，SUBEs在蛋白质中很常见，这些蛋白质包括SIM的串联重复，从而特别识别改性蛋白质上的SAMO分子。使用SUMO结合实体在肝癌中分离和表征SUMOylated蛋白质组是一种快速而敏感的方法。它提供了过去关于相扑通路在肝癌潜在治疗方法中相当未知的作用的信息。

SUMO 结合实体可用于从人类标本和动物模型以及多个细胞模型中分离和描述肝脏以外的其他组织中的 SUMOylat 化蛋白质组。尽管此技术易于执行，但分析同一类型的多个样本时应小心。冷却器立方体到涉及的几个步骤。

因此，我们建议在开始此实验之前小心地从管子上去平。使用SUMO绑定实体的直观演示促进了该协议的革命，特别是因为协议期间处理位的困难和材料的损失。人类肝瘤细胞以前是由P100板的电镀细胞，密度为每盘120万至150万个细胞，并在37摄氏度的标准生长介质中保持。

当准备使用细胞时，从板中吸出介质，用五毫米无菌 PBS 清洗。将盘子放在冰上，并加入500微升的解液缓冲液，根据手稿说明进行补充。然后使用细胞刮刀将板底的细胞轻轻刮入解压介质中。

或者，通过三选一分型收获细胞，并将一毫升三辛-EDTA添加到板中，确保细胞被覆盖。将板放入37摄氏度的培养箱中5分钟，让它们从板中取出，然后加入两毫升预热生长介质，以阻止三辛化。将细胞在150倍G下离心10分钟，吸进上一代。

然后用PBS和离心机再清洗10分钟。吸上流液，并添加500微升的解液缓冲液。将 Lyse 细胞在 15000 倍 G 和 4 摄氏度下离心 10 分钟，然后将超自然液转移到新鲜管中并丢弃颗粒。

当准备使用收获的小鼠肝脏时，在一毫升的冰冷裂解缓冲液中均匀地硬化75毫克新鲜或冷冻碎片。根据手稿指示运行均质器。组织均质化后，将样品在15000倍G和4摄氏度下离心10分钟。

将上一液转移到新鲜管中，然后丢弃颗粒。准备谷胱甘肽珠，在70毫克珠子中加入一毫升去离子水，并在四摄氏度下过夜地重新组成。肿胀后，用10毫升去离子水或PBS洗三次珠子，每次洗涤后以300次G离心5分钟。

洗涤后，将珠子重新用一毫升 PBS 中重新分配，在 100 微克 GST-SUBE 或 GST 控制下获得每个样品 50% 的泥浆，以 100 微升谷胱甘肽珠浆和 500 微升 PBS。在旋转时在4摄氏度下孵育混合物至少两个小时，然后在300次G下离心回收珠子5分钟，并在PBS中重新暂停。服用先前准备的10%的细胞来盐酸，并在3倍沸腾缓冲液的同等体积中稀释。

将澄清的 lysate 的 450 微升添加到谷胱甘肽珠浆的 100 微升中。在四摄氏度下用珠子孵育利盐至少两个小时，同时缓慢旋转。孵育后，在300次G下旋转珠子5分钟，并收集上经剂进行分析。

将总体积的10%转移到单独的管中，并添加3倍沸腾缓冲液的相等体积。将一毫升冰冷PBS加入05%Tween 20，并在300°G和4摄氏度下旋转一分钟，将剩余的样品洗涤三次。小心吸上清液，确保没有液体存在。

然后用15微升的3X沸腾缓冲液和15微升的解解缓冲液对样品进行取样。根据手稿指示进行西部印迹分析。如果执行质谱法，使用阶段尖端 C18 微列子对肽进行脱盐，并在分析前以 0.1% 的甲酸重新暂停。

将样品加载到 LC-MS 系统中，并三次分析。使用相关软件进行蛋白质识别和丰度计算。根据手稿指示进行统计分析。

该协议已被用于分离小鼠的SUMOylated蛋白与甘氨酸N-甲基转移酶缺乏，导致肝癌及其野生类型垃圾伴侣的自发发展。Ponceau S 染色是在 SUBES 下拉检测的输入、流经和绑定分数上进行的。利用 SUBEs 捕获的 LKB1 的西方印迹分析表明，在肝肿瘤中，LKB1 相扑的含量会提高。

人类肝瘤细胞和非转化性肝上皮细胞被用来研究SUMO陷阱与天然SUMOylated蛋白质相互作用的能力。首先，传统的蛋白质染色用于可视化使用 SUBEs 捕获的总材料。然后质谱表明，742种蛋白质在肝瘤细胞苏比样本中丰富，577种蛋白质在肝脏上皮非转化细胞S、苏比样本中含量丰富。

当使用 SUBEs 进行实验时，重要的是在冰上维护细胞和组织，并将特定的毫升添加到解液缓冲液中，以保持 SUMOylated 的纯度。在用 SUBEs 可视化 SUMOylated 蛋白质组后，我们可以使用西方印迹分析或质谱法来查找表征。SUBE在肝癌组织和肝细胞中分离和表征SUMOylated蛋白质组的应用，为探索SUMO在肝癌中翻译后修饰的作用提供了铺平道路，这可能提供一种潜在的治疗机制。