Bu protokol, anokrom hücre heterojenliğini incelemek, nadir hücre tipini belirlemek ve hastalıkta gen regülasyonu için kullanılabilecek tek tek insan adacık hücrelerinin yüksek iş verisi transkripsiyon verilerini oluşturur. Bu teknik, daha büyük ölçekli tek hücreli veri üretir, kullanımı kolaydır ve oldukça kısa işlem süresivardır. Bu yöntem diğer türlerden adacıklara ve yeni izole edilmiş diğer dokuların profiline uygulanabilir.
Ancak, protokolün dokuya özel ayrışma prosedürlerine uyacak şekilde optimize edilmesi gerekir. Yüksek kaliteli ayrışmış hücreler hazırlamak çok önemlidir. Tek hücreli bölümleme den önce hücre süspansiyon QC anahtarıdır, dikkatle ve hızlı bir şekilde emülsiyon işleme gibi.
Bir çipin tıkanıp tıkandığını bilmek gibi bazı kaliteli kontrol noktaları okumaktan daha iyi görülür. İnsan adacıkları elde ettikten ve bir gecede kuluçkaya yattıktan sonra, P200 pipetkullanarak 200 ila 300 adacık sayın ve pikap alın. Adacıkları, önceden 37 santigrat dereceye ısıtılmış, beş milimetrelik tam adacık lı 15 milimetrelik konik bir tüpe aktarın.
Tüpü 200 kez G'de iki dakika santrifüje yerleştirin. Alttaki peleti rahatsız etmeden süpernatant'ı hafifçe aspire edin. Önceden ısıtılmış hücre ayrıştırma çözeltisi bir milimetre ekleyin ve yavaşça yukarı ve aşağı borulama tarafından pelet bozabilir.
Adacıkları 37 derecede 9-11 dakika kuluçkaya yatırın. Her üç dakikada bir, pipet yavaş yavaş 10 saniye boyunca tek hücrelere hücreleri ayırmak için. Adacık hücreleri iyi ayrıştırılmış ve çözüm bulutlu hale geldikten sonra, yeni bir 15 mililitre konik tüp içine 30 mikrometrelik hücresüz ile tam adacık medya dokuz mililitre ekleyin ve filtre.
Hücreleri 5 dakika boyunca 400 kez G'de santrifüj ile toplayın. Supernatant aspire ve 1X PBS 04% BSA çözeltisi 200 ila 300 mikrolitre hücre pelet yeniden askıya. Şimdi, hücre kültürünün 10 mikrolitresini 0,5 mikrolitre AO/DAPI ile karıştırın.
Pipet yukarı ve aşağı iyice karıştırmak için. Bir slayt üzerine 10,5 mikrolitre yükleyin ve sayı ve canlılığı belirlemek için floresan tabanlı otomatik hücre sayacı üzerinde hücre sayısı test çalıştırın. Bir çip kasasına mikroakışkan bir çip yerleştirin.
Talaş kılıfını yönlendirerek, yağ kuyularının deneyi gerçekleştiren kişiye en yakın olmasını sağlar. Hazırlanan tüp şeritler içine hücrelerin hesaplanan hacmi eklemek için bir pipet kullanın. Pipet beş kez karıştırmak için.
Pipet uçlarını atmadan, 90 mikrolitre hücre karışımını çipten birine aktarın. 30 saniye bekleyin, sonra pipet çok yavaş ikinci satıra jel boncuk 40 mikrolitre yüklemek için. Üçüncü sıranın kuyularına 270 mikrolitre bölme yağı dağıtın.
Fiş contasını talaş tutucunun sekmelerine bağla. Monte edilen talaş tutucuyu tek hücreli bölümleme cihazına yerleştirin ve çalıştır düğmesine basın. Tamamlandığında, talaş contasını tutucudan çıkarın, talaş kılıfını 45 derecelik bir açıyla açın ve fişten 100 mikrolitrelik emülsiyonunu mavi plastik 65 kuyu plakalı bir kuyuya aktarın.
Her emülsiyon içine pembe emülsiyon kırma reaktif 125 mikrolitre dağıtın. Bir dakika bekleyin, sonra her kuyunun tüm hacmini her 0,2 mililitrelik tüpe aktarın. Tüp şerit açık ve pembe bir tabaka olduğundan emin olun.
Bir pipetle, berrak katmanı rahatsız etmeden tüp şeridinin altındaki pembe tabakadan 125 mikrolitre çıkarın. Pembe tabakanın yaklaşık 15 mikrolitreküçük bir hacminin tüpte kalması normaldir. Daha sonra her tüp şeritler ve 10 dakika oda sıcaklığında kuluçka karışımı temizlemek 200 mikrolitre ekleyin.
Tüp şeritlerini manyetik bir standa aktarın ve çözümün temizlenmesi için iki dakika bekleyin. Supernatant çıkarın ve atın. Sonra iki kez% 80 etanol ile boncuk yıkayın.
Boncukların bir dakika kurumasını bekleyin. Mıknatıstan tüp şeritler çıkarın ve boncuklar için elüsyon çözeltisi 35,5 mikrolitre ekleyin. Pipet çözeltideki boncukları yeniden askıya almak ve oda sıcaklığında iki dakika kuluçkaya yatırmak için.
Tüp şeritlerini manyetik bir standa aktarın ve çözeltinin temizlenmesini bekleyin. 0.2 mililitrelik tüp şeritlertemizlemek için tüp şeritler saf tamamlayıcı DNA aktarın. Tamamlayıcı DNA'yı yükseltmek için, her numuneye ilk olarak 65 mikrolitre tamamlayıcı DNA amplifikasyon ana karışımı ekleyin.
Tüp şeritleri bir termocycler yerleştirin ve el yazmasına göre programı çalıştırın. Numuneler 72 saate kadar dört santigrat derecede saklanabilir. Tamamlayıcı DNA'yı 15 anagram ve 20 mikrolitreye normalleştirdikten sonra, buz üzerindeki her tamamlayıcı DNA örneğine 30 mikrolitre etiketleme karışımı karıştırın.
Örnekleri termocycler'a koyun ve etiketleme protokolünü 55 derecede beş dakika çalıştırın, 10 santigrat dereceye kadar inin ve tutun. Daha sonra 30 mikrolitre saflaştırılmış tamamlayıcı DNA örneğine 60 mikrolitre örnek indeks PCR Master Mix ve 10 mikrolitre 20 mikromolar forolegol örnek indeksi ekleyin. Son kütüphane ürününü yükseltmek için tüpleri termocycler'a geri döndürün.
Her numuneyi mikrolitre başına iki nanograma kadar suyla normalleştirin ve her normalleştirilmiş numunenin üç mikrolitresini 1,5 mililitrelik bir tüpte bir araya getirin. Mikrolitre başına 0,25 nanogram elüsyon tamponu ile seyreltilmiş havuz. Havuza 12 mikrolitre seyreltilmiş havuz numunesi, bir hayvanın bir mikrolitresi veya DNA kontrolü, iki mikrolitre elüsyon tamponu ve 5 mikrolitre 0,4 normal sodyum hidroksit birleştirerek denatüre.
Karışımı beş dakika kuluçkaya yatırın, sonra pH8'de 200 milimolar Tris'in 10 mikrolitresini ekleyin ve karışımın 4,05 mikrolitresini HTA-1'in 1345,95 mikrolitresine yükleyin. Ardından, sıralayıcının kartuşuna 1,3 mililitre yükleyin ve bir sıralama tarifi kullanarak üreticinin yönergelerine göre çalıştırın. Bilgisayarda, CELL Ranger'ı FASTQ dosyalarına sıralayarak oluşturulan de-multiplex ham temel arama dosyalarına çalıştırın.
FASTQ dosyalarını Human b37.3 genom montajına hizalayın ve ifade nicelleştirmesi elde etmek için CSC gen modelini kullanın. Hücre yle ilişkili barkodların ve arka planın ayrılmasından emin olmak için barkod sıralama çizimini inceleyin. Hücre kalitesini kontrol etmek için, 500'den az tespit edilen gen, 3,000'den az toplam benzersiz moleküler tanımlayıcı sayısı ve 0,2 canlılık puanından daha fazla olan hücreleri hariç tilebilir.
Kesikleri doku ve hücre tiplerine göre ayarlayın. Daha sonra, birden fazla hormon geni ifade hücreleri kaldırmak için R paketi mclust kullanın. Gen ekspresyonunu toplam benzersiz moleküler tanımlayıcılarla normalleştirmek ve hücre düzeyinde 10.000'lik bir ölçek faktörüyle çarpmak için R paketini kullanın.
Daha sonra tüm hücrelerin ortalama ifade ve dağılım kullanarak değişken genleri tespit edin. Kesikleri doku ve hücre tiplerine göre ayarlayın. Değişken genlerle temel bileşen analizini yapın.
Seçili ana bileşen sayısına sahip küme hücreleri. Bir hücre kümesini diğer hücrelerle karşılaştırarak hücre kümesiyle zenginleştirilmiş genler elde edin. Bu tek hücreli RNA sıralama protokolünde, edinilmiş insan adacıkları ilk olarak RNA floresanve C2 hibridizasyonunda alfa ve beta hücreleri tarafından doğrulanmış olarak ayrıştırıldı.
Bölümleme adımı aşağıdaki emülsiyon başarılı bir örnek jel boncuk ayrılmış en az bölümleme yağı ile düzgün bir soluk, bulutlu çözüm gösterir. Buna karşılık, jel boncuk ve yağ arasında net faz ayrımı ile düşük kaliteli emülsiyon talaş çalışması sırasında bir tıkanıklık nedeniyle olabilir. Tamamlayıcı DNA amplifikasyonundan sonra, temsili bir parça büyüklüğündedağılım, 1,000 ila 2,000 baz çiftinin yakınında bulunan iyi kalitede tamamlayıcı DNA örneği için tipik bir tepe yi gösterir.
600 baz çiftine yakın olan artış adacık tamamlayıcı DNA'ya özgüydü. RNA sıralama kitaplıkları için parça boyutlu dağılım 300 ile 500 baz çifti arasındaydı. Kümeleme analizi, T-distributed Stochastic Komşu Katıştırma boyutlarının uzadığı alanda 12 hücre tipi ni ortaya çıkardı.
Alfa hücrelerinde üç, beta hücrelerinde dört alt popülasyon saptadı. Bu teknik, araştırmacıların insan adacıkları için kapsamlı bir hücre adacıkları oluşturmasına olanak sağlar. Diyabetik olmayan ve diyabetik donörlerden daha fazla veri ile, terapötik hedef keşif için kaynak için kullanılır.
