Bu protokol tümörilişkili mutasyonların saptanmasını sağlar ve şu anda invaziv cerrahi prosedürleri tamamlar. Bir diğer güç de tümör mutasyonu yükünü fazla mesai yi izlemek için bu protokolü kullanabilme yeteneğidir. Bu teknik, özellikle zor yerlerdeki tümörler için yararlı olan gerçek cerrahi doku biyopsisine gerek kalmadan tümör genotiplemesini sağlar, örneğin kısıtlı doku erişimi olan beyin sapı gibi.
Tekrar biyopsi yokluğunda, uzunlamasına moleküler veri MRG iltifat için mevcut değildir. Dijital PCR izleme tanı için moleküler tabanlı bir ek kolaylaştırır, daha bilinçli bir tedavi karar verme süreci sağlayan. Benzer yöntemler, konvansiyonel Fluo-4 ve quencher bağlantılı problar ile, ancak kantitatif PCR ile daha yüksek duyarlılık ile, belirli bir sistem genlerin ekspresyonu tespit etmek için kullanılabilir.
Damlacık dijital PCR prosedürüne başlamadan önce tezgah alanını ve ekipmanı %10 çamaşır suyu ve %70 etanol ile temizleyin ve damlacık sabitleme yağı hariç tüm reaktifleri hafifçe girdaplayın ve kısaca santrifüj edin. Sıkıştırılmış azot gaz silindirinin damlacık üreten alete bağlı olduğunu ve silindir tankının inç kare başına 90 pound olarak ayarlandığını doğrulayın. Ve 38 mikrolitre dijital PCR reaksiyon karışımı doğrudan sekiz iyi PCR tüp şerit her kuyunun altına, temiz bir pipet ucu ile herhangi bir kabarcıklar kaldırarak.
Tüp şeridinin uygun kuyularına trilyat olarak 12 mikrolitre önceden güçlendirilmiş DNA örneği ekleyin. Reaksiyon karışımını DNA örneği yle karıştırmak için tam hacim10 kez pipet ve her kuyudan tüm hacmi bir damlacık üreten alet yongasının ilgili A ile H kanallarına kadar olan pipet. Damlacık üreten aletin içine yeni bir PCR tüp şeridi yerleştirin ve enstrüman bilgisayarındaki yazılıma damlacık üreten cihaz çip kimliğini tleyin.
Ardından, örnekleri damlatmaya başlamak için Çalıştır'ı Başlat'ı tıklatın. Damlacıklandırma tamamlandığında, PCR tüp şeridini çıkarın ve tüp şerit kapaklarını uygulayın. Tüp şeridini bir termal döngüce aktarın ve tüpü kuyu başına 80 mikrolitre su içeren başka bir tüp şeridiyle dengeleyin.
Sonra uygun termal bisiklet koşulları altında termal cycler çalıştırın. Şerit kapaklarını yüksek hızlı kapaklarla değiştirin. Termal bisiklet tamamlandığında, tüp şeridini nicelik lendirme aletine aktarın, enstrüman yazılımında Bir Çalıştırma Ayarla'yı tıklatın ve tüp şeridini niceliklendirme aletine yerleştirin.
Metal kalkanı yeni bir nicelik selamı çipinin üzerine yerleştirin, çip kimliğini aletin içine takın ve çipi makineye takın. Aletin kapağını kapatın. Bilgisayar yazılımında, dijital PCR çalıştırış için bir ad girin ve sekiz kanalın her biri için, ardından Hızlı Mod'u seçin ve nicelemeye başlamak için Başlat'ı tıklatın.
Ham spektral verileri analiz etmek için, analist yazılımını başlatın ve fcs dosyalarını açın. Analiz görünümü altında, bozulmadan seçin. Örnek görünümün altında, sekiz örneğin her birinin yanındaki kutuları tıklatın.
Yazılım sırasıyla x ve y ekseni boyunca mutant ve yabani tip aleliçin sinyalleri çizecektir. Üretici eğitmenlere göre, bozulmamış damlacıklara spektral kompansasyon uygulamak ve eksen seçenekleri altında eksen ayarlarını ayarlamak için hesaplanan matris işlevini kullanın. X eksenini en az sıfır ve en fazla 30,000 ve y eksenini en az eksi 5, 000 ve en fazla 10,000 olarak ayarlayın.
Damlacık kümeleri tanımlandığında, grafikteki boş alanı azaltmak için ekseni ayarlayın. Negatif mutant ve yabani tip kapıları ayarlamak için pozitif kontrol tümör doku genomik DNA karşılık gelen örnek seçin, kümeleri farklı ve kolayca tespit sağlamak. Ardından, pozitif denetim için kapı ayarlarını tüm örneklere uygulamak için Seçili Örneklere Tüm Ayarları Uygula'yı sağ tıklatın ve seçin.
Grafik görünümü altında, seçili örneklerin tümünün çizimlerini görüntülemek ve görüntüyü tif dosyası olarak dışa aktarmak için birden çok örneği tıklatın. Ardından Çalışma Alanı altında Dışa Aktarma Çözümlemesi'ni seçin ve çözümlenen veri dosyasını csv dosyası olarak kaydedin. Burada, diffüz orta hat gliomları olan iki çocuktan önceden güçlendirilmiş plazma ve beyin-omurilik sıvısı hücre serbest DNA'sında mutasyonun başarılı bir şekilde saptanması için temsili sonuçlar gösterilmiştir.
Bu deneyde, sırasıyla x ve y ekseni boyunca mutant ve yabani tip kümeler arasında net bir ayrım gözlemlenebilir. Sağlam vahşi tip kümeler, şablon DNA'sı mevcut olduğu için hücre serbest DNA çıkarma nın başarılı olduğunu gösterir. Bu hastalar için, mutant kümeler biyopsili tümör dokusunun genomik analizi ile doğrulanan tümör mutasyon durumuna uygun olarak plazma ve beyin-omurilik sıvısı örnekleri için sırasıyla yüzde 1.6 ve 39.32 mutasyon allelik sıklığı göstermektedir.
Öte yandan negatif kontrol, PCR reaksiyon karışımında kontaminasyon olmadığını gösteren sıfır mutant ve sıfır yabani tip damlacıklar göstermektedir. Pozitif kontrol tümör dokusu genomik DNA seçilen tümör örneği için beklenen allelik frekansta tespit edilen mutasyonu gösterir. Plazma içinde mutasyon tespitinin olmaması, yanlış negatifler meydana geldiğinden, hastanın ilgi mutasyonu için yabani bir tip olduğu anlamına gelebilir.
Örneğin, bu hastada, ilgi mutasyonu saptanamamasına rağmen, mutasyon durumu tümör dokusunun genomik analizi ile doğrulandı. PCR yanlış pozitif veri elde önlemek için çalışma alanı ve ekipman sık dekontaminasyon gerektiren çok hassas bir tekniktir.
