Voltaj duyarlı boya ile optik kayıt yöntemi beynin nasıl çalıştığını görselleştirmek için ideal bir teknoloji olduğu düşünülmektedir. Bu yöntem bize psişik aktivite hakkında bir görünüm verilen, 12 saat içinde bir nöropsizor dinamikleri stably ve güvenilir kayıt için izin verdi. Biz anneler için değerli asit uygulaması gibi geliştirme nin tüm aşamasında kimyasalların neden olduğu devre değişiklikleri tespit etmek için uygulama genişletmek için çalışıyoruz.
Teknik zaten iyi kurulmuştur. Lütfen burada sunulan yöntemi izleyerek çalışmaları yeniden oluşturmaya çalışın. Bu prosedüre başlamak için, kafası kesilmiş başı buz gibi ACSF'ye paslanmaz çelik cerrahi tepsiye batırın.
Bir dakika içinde beyin ayıklayın ve beş dakika boyunca soğutulmuş ACSF içeren bir beher yerleştirin. Daha sonra, bir neşter ile orta hatta beyin bölümü bölmek ve% 4 agar blok üzerine her iki yarımkürede yerleştirin. Sonra, her iki yarımküreile beyin bloğu yerleştirin 4% agar blok üzerine.
Fazla ACSF'yi bir filtre kağıdıyla bloktan silin. Daha sonra, vibratom platformuna superglue uygulayın. Üzerine agar blok yerleştirin ve bir filtre kağıdı ile aşırı yapıştırıcı silin.
Yavaşça fazla superglue katılaşmaya yardımcı olmak ve beyin kapsayan ve dilimleme rahatsız tutkal önlemek için beyin agar blok üstünden buz gibi ACSF az miktarda uygulayın. Daha sonra, vibratom tepsisine platform düzeltmek ve değiştirilmiş ACSF dökün. Vibratomu yavaş bir hıza ayarlayın ve bıçak frekansını maksimum ayarında ayarlayın.
O zaman dilimlemeye başla. Dilimlerin sırası kolayca ayırt edilebilmesi için dilimleri sırayla dilim odasının köşesine yerleştirin. Genellikle bir yarımküreden 3-5 dilim elde edilebilir.
Sonra, 30 gauge iğne kullanarak beyin sapı kısmını kesti. Küçük uçlu bir boya fırçası kullanarak, dilimi pleksiglas halkaile tutulan membran filtresine yerleştirin. Halkayı nemli bir geri kazanım odasına yerleştirin ve iç basıncı yüksek tutmak için kapağı sabitlayın.
Dilimi membran filtresine yerleştirirken, dilimin halka içindeki yönünü ve konumunu iyi ortalandığından ve tutarlı bir yöne sahip olduğundan emin olmak için ayarlayın. Numuneyi 28 derecede 30 dakika, oda sıcaklığında ise en az 10-30 dakika bekletin. Dilimleri boyamak için, boyama çözeltisinin 100 mikrolitresini her dilimin üzerine hafifçe uygulayın ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın.
Ardından, bir kapta 50 ila 100 mililitre ACSF hazırlayın. Boyama çözeltisini durulamak için halkayı numunenin içinde yerleştirin. Daha sonra, durulanan dilimleri başka bir kuluçka odasına aktarın.
Denemeden önce iyileşme için bir saatten fazla bekleyin. Bu yordamı başlatmak için amplifikatör, bilgisayar ve kamera sistemini açın ve yazılımı açın. 50 mililitrelik bir tüp acsf dökün ve carbogen ile kabarcık.
ACSF'yi sirküle etmek ve akış hızını dakikada yaklaşık bir mililitreye ayarlamak için peristaltik bir pompa kullanın. Daha sonra emme pipetinin yüksekliğini, deney odasının içindeki sıvı seviyesinin her zaman sabit olması için ayarlayın. Zemin elektrot'u odaya yerleştirin.
Daha sonra, cam elektrot acsf küçük bir miktar ile doldurun ve elektrot tutucu yerleştirin. Tutucuyu manipülatörün çubuğuna takın. Bir amplifikatör kullanarak, elektrot direnci yaklaşık bir megaohm olduğundan emin olun.
Kayıt oturumunda, nemli odadan deneysel bir odaya bir dilim aktarın. Halkanın kenarına silikon o-halkaya sıkıca bastırın. Deney odasının zarını veya altını kırmamaya dikkat edin.
Mikroskop altında uyarıcı elektrot ucu ve alan potansiyel kayıt elektrot dilim yerleştirin. Bir uyarıcı sunarak uyarılmış yanıtı kontrol edin. Görüş alanının optik kayıt sistemindeki doğru sinir devresini kapsadığını doğrulayın.
Ardından, uyarma ışık yoğunluğunu kameradaki maksimum kapasitenin yaklaşık %70 ila %80'ine ayarlayın. Floresan ışık kaynağını kullanarak, odak satın alma sistemi ile ayarlayın. Ardından, kaydı başlatın ve satın alma dan sonra bir görüntü edinme yazılımındaki verileri analiz edin.
Bu rakam bir fare hipokampal dilim alan CA1 Schaffer collaterol elektrikstimülasyon üzerine temsili optik sinyal gösterir. Bu ardışık görüntüler, herhangi bir aralıklı ve zamansal filtre uygulanmadan önce optik sinyali gösterirken, bu görüntüler beşe beş kübik filtreyi iki kez uyguladıktan sonra aynı verileri gösterir. Yüksek kare hızı ve yüksek uzamsal çözünürlük nedeniyle, filtreuygulaması sinyali değiştirmedi, ancak tek bir denemede pikselolarak kaydedilen zaman diliminde de gözlemlenebilen gürültüyü filtreledi.
Burada fare ve sıçan arasındaki hipokampal dilimlerin alan CA1 tipik tepkilerin karşılaştırılmasıdır. Fare hipokampal diliminde 24 milisaniye sonra CA1 distal tarafında küçük hiperpolarize yanıt gözlenir, ancak daha büyük hiperpolarize yanıt sıçan hipokampal dilimde depolarize yanıt geçti. Dilimler boyandıktan sonra 12 saatten fazla dayanmalıdır ve üzerlerinde başka elektrofizyolojik kayıtlar yapabilirsiniz.
